瘦肉型猪（PIC344）精液碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究

在对瘦肉型猪（PIC344）精液碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，EC．3．1．3．1，简称AKP）分离纯化的基础上，对其性质进行了初步研究。将精液反复冻融后，用正丁醇抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子色谱和Sephacryl S-200分子筛色谱后，得到纯化倍数11.46，比活为81.23U／mg酶蛋白。提取液经PAGE和SDS-PAGE检测，呈现一条带。用Sephacryl S-300柱色谱系统（AKTA FPLC）测得该酶相对分子质量为90.12KD，SDS-PAGE电泳法测得该酶亚基分子质量为48.41KD，说明该酶为两个相同亚基组成。天然等电聚焦显示其等电点（pI）为8.19。氨基酸组成分析显示：瘦肉型猪（PIC344）精液的碱性磷酸酶亚基由大约450个氨基酸残基组成，富含门冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。 动力学方法测得该酶的最适pH值9.5，最适温度为40℃，对热较为稳定。以磷酸苯二钠为底物测得Km值为3.98×10-4mol／L。金属离子在1-8mmol／L的浓度范围内，检测酶活，结果发现Cd2+，Cu2+离子对酶活有不同程度的抑制作用；Ni2+，Ca2+，Mg2+离子对酶活有不同程度的激活作用。选用CuSO4，Cd（NO3）2作酶的抑制类型判断，结果表明CuSO4为非竞争性抑制，抑制常数为1.32×10-3mol／L，Cd（NO3）2为竞争性抑制，抑制常数为3.33×10-4mol／L。四川人学硕「学位论文 用N一嗅代墟拍酞亚胺（NBS），苯甲基磺酞氟（PMSF），三硝基苯磺酸（TNBS），二琉基苏糖醇（DTT），嗅代乙酸（AcBr）在一定条件下分别选择性的作用于Plc344A对的T甲，ser，Lys，His及琉基，并对酶活力的变化和吸收光谱的变化作了测定，结果表明，NBS，TNBS，PMSF， DTT的修饰能显著的抑制AKP的活力，活力的降低与修饰剂的浓度呈正相关;AcBr的修饰对AKP的活力没有明显的影响。结果表明T印，Ser，切s及琉基可能是AKP的活力的必须基团。关键词:瘦肉型猪;精液;碱性磷酸酶;分离纯化;性质 2 乡