猪THRSP基因启动子SNP及其对基因表达的影响

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猪肉是中国消费者动物蛋白质来源之一,猪肉品质一直倍受人们的关注。猪肉中的脂肪及其含量是猪肉品质和风味形成的重要决定因素,决定了猪肉的多汁性和口感。THRSP基因参与调控猪肉脂肪沉积,该基因的变异是调节脂肪合成和分解相关基因表达的关键因素。本研究以定远猪类群为材料,检测获得T HRSP基因启动子区5个SNP位点,构建了5个基因型的双萤光素酶报告基因重组质粒,并与pRL-CMV质粒共转染293T细胞,利用荧光素酶检测系统对转染细胞进行检测,分析不同基因型启动子的效率,并通过THRSP基因表达的实时荧光定量PCR和不同类型猪该基因的频率分布验证结果,分析启动子SNP位点与THRSP基因表达之间的关联性。结果表明:研究所发现的5个突变位点分别是位于CDS上游的A-95T、G-98A、A-376G、T-400C和C-459T,并且位于THRSP基因的启动子区域。利用5个SNP位点的联合基因型构建双萤光素酶报告基因重组质粒,与pRL-CMV共转染293T细胞,检测其转染后的启动子效率以TCAGA联合型最高,TCAGA的启动效率较CTGGA高129%,CCAGA、 CTAGA和CTGAT的启动效率较CTGGA分别低99%、73.2%和42.6%。TCAGA的启动子效率较CCAGA高75%,CCAGA比CTAGA低96.6%。分析THRSP基因的表达水平与不同启动子效率呈显著的相关性(P<0.05),并上瘦肉型猪群和脂肪型猪群这些SNP位点的基因频率分布规律一致。可见,THRSP因启动子区的A-95T、G-98A、A-376G、T-400C 和 C-459T位点是THRSP基因表达水平差异的关键调控者。
摘要第5-6页
Abstract第6页
略词语表(Abbreviation)第7-11页
文献综述第11-19页
1 引言第19-20页
2 材料和方法第20-30页
    2.1 样品采集及主要试剂和仪器第20-21页
        2.1.1 样品采集第20页
        2.1.2 主要试剂第20页
        2.1.3 主要仪器设备第20-21页
        2.1.4 溶液和试剂配制第21页
        2.1.5 数据分析软件第21页
    2.2 DNA提取与检测第21-22页
        2.2.1 猪耳组织DNA提取第21-22页
        2.2.2 DNA浓度检测第22页
    2.3 目标片段的扩增及检测第22-23页
        2.3.1 引物设计第22页
        2.3.2 目标片段的扩增第22-23页
        2.3.3 1%的凝胶电泳检测第23页
    2.4 PCR产物纯化和基因型筛选第23-24页
    2.5 pGL3-Basic-THRSP-promoter重组质粒的建立第24-26页
        2.5.1 pGL3-Basic载体和目的片段PCR纯化产物双酶切第24页
        2.5.2 双酶切产物的纯化第24页
        2.5.3 连接反应第24-25页
        2.5.4 连接产物转化感受态细胞第25页
        2.5.5 菌液PCR鉴定第25页
        2.5.6 重组质粒提取第25-26页
        2.5.7 重组质粒的鉴定第26页
    2.6 293T细胞培养第26-27页
        2.6.1 293T细胞的复苏第26-27页
        2.6.2 台盼蓝染色细胞计数第27页
        2.6.3 细胞传代第27页
    2.7 重组质粒的细胞转染第27-28页
    2.8 实时荧光定量PCR验证第28页
    2.9 统计分析第28-30页
        2.9.1 基因频率计算方法第28-29页
        2.9.2 双萤光素酶检测及方差分析第29页
        2.9.3 不同类型猪基因频率分布第29-30页
3 结果与分析第30-35页
    3.1 THRSP基因启动子片段的PCR扩增结果第30页
    3.2 目的片段的序列及其SNPs第30-31页
    3.3 不同类型猪THRSP基因启动子SNP分布特点第31-33页
    3.4 不同启动子的双报告基因表达结果第33-34页
        3.4.1 构建双萤光素酶报告基因重组质粒第33页
        3.4.2 不同启动子的双报告基因表达结果第33-34页
    3.5 启动子变异与THRSP基因表达的关联性第34-35页
4 讨论第35-39页
    4.1 猪脂肪沉积第35-36页
    4.2 启动子SNP位点与基因表达调控的关系第36-37页
    4.3 不同类型猪的基因频率的分布第37-39页
5 结论第39-40页
参考文献第40-48页
致谢第48-49页
作者简介第49页
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