死亡受体凋亡通路与脂肪基质细胞分化为神经元反应的关系

ADSC论文 诱导分化反应论文 神经元论文 FAS/FASL论文 TNFR1/TNF-α论文 DR5
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目的探讨应用以β-巯基乙醇为主要成分的诱导剂体外诱导成人脂肪基质干细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)分化为神经元的反应与FAS/FASL、TNFR1/TNF-α、DR5/TRAIL信号转导通路的关系。为提高诱导反应效率、增加诱导后存活细胞数量和延长其存活时间提供理论依据,进而为神经退行性变疾病的细胞移植提供新的思路与策略。方法1对吸脂术后所得的脂肪组织进行分离、提取、培养为ADSC。2应用β-巯基乙醇为主要成分的诱导剂诱导传代至第3代的生长状态良好的ADSC,使其向神经元方向分化,根据β-巯基乙醇含量及诱导时间长短不同,可对细胞进行分组:未诱导组、预诱导组及诱导1h、3h、5h、8h组。3应用免疫细胞化学法检测未诱导组及预诱导组、诱导分化1h、3h、5h、8h组的神经元特异性烯醇化酶(Neurons specific enolase,NSE),死亡受体及其配体FAS/FASL、TNFR1/TNF-α、DR5/TRAIL,细胞凋亡因子Caspase 8及Caspase 3的表达情况。4 Western-blotting法检测未诱导组及预诱导组、诱导1h、3h、5h、8h组细胞的NSE、FAS/FASL、TNFR1/TNF-α、DR5/TRAIL、Caspase 8、Caspase 3的表达情况。5 MTT法检测未诱导组和诱导分化为神经元过程中各组细胞的存活情况。6应用流式细胞术Annexin/PI双染法定量检测未诱导组及预诱导组、诱导分化1h、3h、5h、8h组的存活细胞及早期凋亡细胞的数量。7统计学方法:分别应用Excel 2007与SPSS13.0统计软件包对实验中所得所有数据建立数据库并进行统计学分析。采用单因素方差分析对同组间不同时间点进行比较,采用SNK-q检验的方法对组间均数进行比较,检验水准取双侧α=0.05,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1由健康青年脂肪组织中提取的ADSC于24h时已贴壁生长。贴壁后细胞开始增殖,传代至(3-5)代时,形态也逐渐趋于一致,以长梭形细胞为主,并呈漩涡状生长。2预诱导组的神经元已经开始分化,突起小且数量少。正式诱导1h组的细胞可见细胞核开始变大且圆,细胞质略有回缩,突起较预诱导组增长。诱导3h组的细胞可见细胞质周围略有光圈,突起结构进一步伸长,类似于神经元轴突样结构,且突起结构数量略增加,并发现其交织成网络状。诱导5h组的细胞折光性进一步增强,细胞外可见明显光晕,一些细胞突起的末端出现细小的分支,发现其与树突细胞结构相类似,神经元细胞形态典型。诱导8h组的部分分化细胞的形态发生退化,突起缩短,且漂浮的死亡细胞数量增多。3免疫细胞化学法在未诱导组ADSC未检测到NSE的阳性表达,在预诱导组及诱导1h、3h、5h、8h组均有阳性表达,阳性表达部位主要位于细胞浆和突起,且诱导5h组的阳性表达率明显高于诱导1h、3h组(P<0.05),但与诱导8h组阳性表达率无统计学差异(P>0.05)。FAS、FASL、TNFR1、TNF-α、DR5、TRAIL在未诱导组、预诱导组及诱导反应过程中的各组均发现细胞的阳性表达,且阳性细胞的表达主要在细胞浆和突起部位,且随着诱导反应时间延长,其表达水平明显逐渐升高,其中FAS、FASL的表达在8h组达到高峰(P<0.05),TNFR1、TNF-α及DR5、TRAIL在5h组最高(P<0.05)。Caspase 8的表达随着诱导时间的延长逐渐升高,在8h达到高峰(P<0.05)。Caspase 3的表达水平随着诱导时间的延长逐渐升高,在5h进入高峰期(P<0.05),其中5h组与8h组无统计学差异(P>0.05)。4应用Western-blotting法在未诱导组未检测到NSE的阳性表达,在诱导第5h组明显高于1h、3h(P<0.05),但与8h组无统计学差异(P>0.05)。FAS、FASL、TNFR1、TNF-α、DR5、TRAIL的表达随着诱导反应时间的延长而逐渐升高,其中FAS、FASL的表达在8h组达到高峰(P<0.05),TNFR1、TNF-α及DR5、TRAIL在5h组最高(P<0.05)。Caspase 8表达随着诱导时间的延长逐渐升高,在8h达到高峰(P<0.05)。Caspase 3表达水平随着诱导时间的延长逐渐升高,在5h进入高峰期(P<0.05),其中5h组与8h组无统计学差异(P>0.05)。5应用MTT法检测的存活细胞的吸光度值在未诱导ADSC组,预诱导组,诱导1h,3h,5h,8h组逐渐下降。6流式细胞术Annexin/PI双染法的结果提示,ADSC在诱导分化为神经元过程中,细胞存活率随着分化时间的延长而逐渐减少,细胞早期凋亡率随着分化时间的延长而逐渐升高。结论ADSC分化为神经元的过程中导致细胞死亡的主要原因之一是死亡受体及其配体系统介导的细胞凋亡。其中,TNFR1/TNF-α和DR5/TRAIL通路介导的细胞凋亡主要在这种诱导反应的前5h作用显著,5h以后则作用明显减弱。但FAS/FASL途径引发的细胞凋亡在整个诱导反应过程中均很明显。
摘要第4-6页
Abstract第6-7页
英文缩略表第10-11页
引言第11-13页
第1章 实验研究第13-48页
    1.1 材料与方法第13-26页
        1.1.1 材料第13-18页
        1.1.2 实验方法第18-26页
    1.2 结果第26-41页
        1.2.1 ADSC原代培养及传代后的细胞形态学变化特征第26-27页
        1.2.2 ADSC诱导分化为神经元过程中细胞形态学变化特征第27-28页
        1.2.3 免疫细胞化学法检测ADSC诱导分化为神经元过程中NSE/ FAS/ FASL/ TNFR1/ TNF-α/ DR5/ TRAIL/ Caspase 8 / Caspase 3 的表达情况第28-35页
        1.2.4 ADSC诱导分化为神经元过程中NSE/ FAS/ FASL/ TNFR1/ TNF-α/ DR5/ TRAIL/ Caspase 8/ Caspase 3 表达水平的western blotting法检测结果第35-39页
        1.2.5 ADSC及ADSC诱导分化为神经元细胞过程中各组细胞生长状态的MTT法检测结果第39-40页
        1.2.6 ADSC诱导分化为神经元过程中各组细胞凋亡率的检测结果第40-41页
    1.3 讨论第41-44页
    1.4 小结第44页
    参考文献第44-48页
第2章 综述死亡受体途径的研究进展第48-53页
    2.1 FAS/FASL途径第48-49页
    2.2 TNFR途径第49-50页
    2.3 TRAIL途径第50-51页
    参考文献第51-53页
结论第53-54页
致谢第54-55页
导师简介第55-56页
作者简介第56-57页
学位论文数据集第57页
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