Rho/Rho激酶信号通路和肝细胞生长因子在2型糖尿病大鼠肾病中的作用

目的:糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。本研究通过测定2型糖尿病大鼠肾脏Rho激酶(ROCK)的活性、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平，探讨Rho/ROCK信号通路对HGF和TGF-β1的调控作用以及ROCK特异性抑制剂Fasudil对糖尿病肾脏的保护作用，为DN的防治提供一个新的策略。方法:高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ)单次腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，并设立正常对照组(NC组)。第10w末，进行高胰岛素正常血糖钳夹试验，测定葡萄糖输注率(GIR)，验证糖尿病大鼠存在胰岛素抵抗；称取大鼠体重(BW)；并收集空腹静脉血标本检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)。将糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(DM组)和Fasudil干预组(DF组，10mg/kg/d，i.p.)。之后监测BW、血糖及鼠尾收缩压(SABP)。第24w末，留取24h尿液标本，测定尿白蛋白排泄率(UAER)；取空腹静脉血标本测定FBG、FINS、TG、TC、糖化血红蛋白(HbA1c)、血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)；根据FBG和FINS计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；称取大鼠体重(BW)；称取肾脏重量(RW)，计算肾脏重量/体重比值(RW/BW)；应用Masson染色和HE染色观察各组肾脏组织形态的改变；取肾脏组织测定羟脯氨酸(HYP)含量；应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测肾脏组织中HGF和TGF-β1的mRNA表达水平；应用Western blot方法检测肾皮质磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)水平，用来表示ROCK的活性。结果:1BW的变化高脂饮食的大鼠BW增加明显。第10w末，糖尿病大鼠的BW明显高于NC组大鼠(P＜0.05)。以后糖尿病大鼠的BW有所下降。第24w末，DM组和DF组大鼠的BW明显低于NC组大鼠(P＜0.05)，DF组与DM组大鼠的BW相比没有统计学差异(P＞0.05)。2血生化指标的变化第10w末，糖尿病大鼠的FBG、FINS、TG和TC均明显高于同期NC组大鼠(FBG、FINS和TG，P＜0.01；TC，P＜0.05)。第24w末，DM组和DF组大鼠的FBG、FINS、TG、TC和HbA1c明显高于同期NC组大鼠(P＜0.01)，而DF组大鼠的上述指标与DM组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。3胰岛素抵抗指标的变化第10w末，糖尿病大鼠的GIR明显低于NC组大鼠(5.45±0.84mg/kg/minvs11.34±0.76mg/kg/min， P＜0.01)。第24w末，根据FBG及FINS计算HOMA-IR，结果DM组和DF组大鼠的HOMA-IR明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，DF组大鼠的HOMA-IR与DM组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。4SABP测定结果第24w末，测得各组间大鼠SABP相比较没有统计学差异(P＞0.05)。5RW，RW/BW结果第24w末，DM组大鼠的RW明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，DF组大鼠的RW明显低于DM组大鼠(P＜0.01)，与NC组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。DM组大鼠的RW/BW明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，DF组大鼠的RW/BW明显低于DM组大鼠(P＜0.01)，与NC组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。6BUN、Cr及UAER结果第24w末，DM组和DF组大鼠的BUN水平明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，DF组大鼠的BUN水平和DM组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。三组大鼠的Cr水平相比较没有统计学差异(P＞0.05)。DM组大鼠的UAER水平明显高于NC组大鼠(0.35±0.04vs0.05±0.01，P＜0.01)，而DF组大鼠的UAER水平明显低于DM组大鼠(0.08±0.04vs0.35±0.04，P＜0.01)。7肾脏组织HYP测定结果第24w末，DM组大鼠肾脏组织HYP含量明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，而DF组大鼠HYP含量明显低于DM组大鼠(P＜0.01)，与NC组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。8Masson染色结果NC组大鼠肾间质及血管周围可以见到少量胶原纤维的分布。DM组大鼠与NC组大鼠相比，肾间质及血管周围的胶原纤维明显增多(胶原面密度0.148±0.007vs0.076±0.005，P<0.01)。DF组大鼠与DM组大鼠相比，肾间质及血管周围胶原纤维明显减少(胶原面密度0.079±0.007vs0.148±0.007，P<0.01)。DF组大鼠的胶原纤维与NC组大鼠相比没有统计学差异(胶原面密度0.079±0.007vs0.076±0.005，P>0.05)。9HE染色结果NC组大鼠肾小球结构正常；肾小管上皮细胞排列整齐，胞浆丰富。与其相比，DM组大鼠肾小球肥大，系膜区明显扩张，系膜基质增多；肾小管上皮细胞结构紊乱，胞浆丢失，泡沫样变。DF组大鼠上述改变均较DM组大鼠明显减轻。10肾脏组织HGF及TGF-β1mRNA的表达DM组大鼠肾脏HGF mRNA表达明显低于NC组(P＜0.01)，而DF组大鼠肾脏HGF表达明显高于DM组(P＜0.01)，与NC组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。DM组大鼠肾脏TGF-β1mRNA表达明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，而DF组大鼠肾脏TGF-β1mRNA表达明显低于DM组大鼠(P＜0.01)，与NC组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。11肾皮质组织中的磷酸化MYPT1水平DM组大鼠肾皮质组织的磷酸化MYPT1表达量明显高于NC组大鼠(P＜0.01)，而DF组磷酸化MYPT1表达量明显低于DM组大鼠(P＜0.01)，与NC组大鼠相比没有统计学差异(P＞0.05)。结论:1高脂饮食联合小剂量STZ一次性腹腔注射造成大鼠高血糖、高血脂和胰岛素抵抗，提示2型糖尿病大鼠模型制造成功。2高血糖能够激活肾脏Rho/ROCK信号通路，参与调控了HGF和TGF-β1的表达，导致了肾小球系膜区细胞外基质积聚，在DN的发病机制中起着重要作用。3ROCK抑制剂Fasudil能够改善糖尿病大鼠的肾纤维化，减少尿蛋白，这种肾保护作用可能是通过上调HGF的表达，恢复HGF和TGF-β1之间的平衡而实现的。ROCK有可能成为DN治疗的新靶点。