肌肉生长抑制素(Myostatin),简称肌抑素,属TGF-β超家族的一员,它是骨骼肌生长发育的负调控因子。本研究旨在以小鼠成肌细胞系C2C12细胞为模型,探讨Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径。本研究共包括以下五部分实验:实验一Myostatin对JNK信号途径的影响在掌握C2C12细胞生长特性的基础上,为体外研究Myostatin是否对JNK信号途径产生影响并确定其最佳添加浓度,首先利用不同浓度的重组鼠Myostatin蛋白处理C2C12细胞,1 h后收集细胞提取总蛋白,利用磷酸化JNK抗体进行Western blot分析。结果表明,添加50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白组的杂交信号最强。确定最佳添加浓度后,为进一步研究细胞在增殖和分化过程中Myostatin是否对JNK信号途径产生影响及了解这种影响是否具有时间效应,分别在增殖和分化两种培养条件下利用50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白处理C2C12细胞不同时间,然后在不同时间点收集细胞提取总蛋白,利用多种抗体进行Western blot分析。结果表明:增殖过程中,细胞内JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出现轻微提高,在1 h达到最大,随后逐渐下降;分化过程中,细胞内JNK磷酸化水平在Myostatin作用20 min出现第一次提高,在40 min回落到对照组水平,在1 h后出现第二次提高并持续到4 h:细胞增殖和分化过程中,Myostatin激活JNK这一事件被Myostatin激活c-Jun(JNK信号途径下游信号分子)进一步所证实,并且细胞内c-Jun磷酸化水平的变化具有与JNK磷酸化水平变化相类似的规律;细胞增殖和分化过程中,JNK总蛋白水平在各处理前后维持恒定。本实验首次证实了C2C12细胞增殖和分化过程中Myostatin能够激活JNK信号途径。实验二ActRⅡB在Myostatin激活JNK中的作用为获得能够有效下调ActRⅡB基因表达的小干扰RNA(siRNA)分子,采用阳性对照GAPDH siRNA确定的最佳脂质体转染条件,将三对用于下调ActRⅡB基因表达的siRNA(Ambion siRNA ID 59935、ID 60120或ID 162114)转染到C2C12细胞中,48 h后收集细胞提取总RNA,利用实时荧光定量PCR方法分析细胞内ActRⅡB基因表达的变化。结果表明:和对照组相比,Ambion siRNA ID59935、ID60120和ID 162114分别下调了细胞内ActRⅡB基因的mRNA表达水平46.68%、27.46%和60.92%。为研究Myostatin激活JNK是否由AetRⅡB所介导,采用最佳脂质体转染条件,将AmbionsiRNA ID 162114转染到C2C12细胞中,48 h后添加50 ng/mL重组鼠Myostatin蛋白处理1 h,然后收集细胞提取总蛋白,利用磷酸化JNK抗体进行Western blot分析。结果表明,有效下调ActRⅡB基因表达后,Myostatin激活JNK的程度受到显著地削弱。本实验证实了Myostatin激活JNK是由ActRⅡB所介导。实验三TAK1-MKK4信号通路在Myostatin激活JNK中的作用为获得能够高效下调TAK1和MKK4基因表达的小干扰RNA(siRNA)分子,采用最佳脂质体转染条件,分别将三对用于下调TAK1基因表达的siRNA(AmbionsiRNA ID94455、ID 94549或ID 189006)和三对用于下调MKK4基因表达的siRNA(Ambion siRNA ID 64447、ID 64539或ID 186583)转染到C2C12细胞中,48 h后收集细胞提取总RNA,利用实时荧光定量PCR方法分析细胞内TAKl和MKK4基因表达的变化。结果表明:和对照组相比,Ambion siRNAID94455、ID94549和ID 189006分别下调了细胞内TAK1基因的mRNA表达水平33.34%、46.73%和79.97%,AmbionsiRNA ID64447、ID64539和ID 186583分别下调了细胞内MKK4基因的mRNA表达水平85.19%、79.18%和69.59%。为研究Myostatin激活JNK是否由TAK1和MKK4所介导,采用最佳脂质体转染条件,分别将Ambion siRNA ID 189006或Ambion siRNAID 64447转染到C2C12细胞中,48 h后添加50 ng/mL重组鼠Myostatin蛋白处理1 h,然后收集细胞提取总蛋白,利用多种抗体进行Western blot分析。结果表明,高效下调TAK1基因表达后,JNK被Myostatin激活的程度受到削弱,而高效下调MKK4基因表达后,JNK几乎不被Myostatin所激活。以上结果表明,Myostatin是通过TAK1-MKK4信号通路而激活JNK。实验四JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化中的作用采用MTT法进行细胞增殖分析,结果表明:和对照组相比,添加50 ng/mL重组Myostatin蛋白处理C2C12细胞24 h抑制了细胞增殖约20%(P=0.28),而添加10μmol/L JNK特异性抑制剂SP600125阻断JNK信号途径后,Myostatin则失去了抑制细胞增殖的能力。Myostatin抑制成肌细胞增殖常与p21基因表达上调密切相关。为检测细胞增殖过程中Myostatin是否对p21基因表达产生影响,实验对80%左右汇合的C2C12细胞用50 ng/mL重组鼠Myostatin蛋白分别处理2 h、4 h和6 h。实时荧光定量PCR结果表明,Myostatin上调p21基因表达最佳作用时间为4 h。为检测细胞增殖过程中JNK是否在Myosstatin上调p21基因表达中发挥作用,实验对80%左右汇合的C2C12细胞用10μmol/L SP600125预先处理1h后,再用50 ng/mL重组Myostatin蛋白处理4 h。实时荧光定量PCR结果表明,p21基因表达mRNA水平在Myostatin处理4 h后上调了约3.5倍,而存在SP600125时,Myostatin上调p21基因表达的能力则受到一定程度的削弱。Western blot分别结果表明,p21基因表达蛋白水平的变化与其mRNA水平的变化类似。Myostatin抑制成肌细胞分化常与分化相关基因表达下调密切相关。为检测JNK是否在Myostatin下调分化相关基因表达中起作用,C2C12细胞在增殖培养液生长至80%左右汇合时,更换为分化培养液继续培养24 h,然后于分化培养条件下用10μmol/L SP600125预先处理1 h后,再用50 ng/mL重组Myostatin蛋白处理24 h,分别利用实时荧光定量PCR和Western blot分析分化标志基因myogcnin和MyoD基因表达mRNA和蛋白水平的变化。结果表明,myogenin基因表达mRNA和蛋白水平分别在Myostatin处理24h后下调了40%和80%,MyoD基因表达mRNA和蛋白水平分别在Myostatin处理24 h后下调了25%(P=0.13)和63%,而存在SP600125时,Myostatin下调myogenin和MyoD基因表达的能力均受到一定程度的削弱。以上结果表明,JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化中发挥了重要作用。实验五MKK4 siRNA对Myostatin下调分化相关基因表达的影响在分化培养条件下Ambion siRNA ID 64447依然能够高效下调MKK4基因表达的前提下,采用最佳脂质体转染方法,将MKK4基因特异的siRNA(Ambion siRNA ID64447)转染到C2C12细胞中,48 h后更换成含50 ng/mL重组鼠Myostatin蛋白的分化培养液再培养48 h,然后收集细胞提取总蛋白,利用多种抗体进行Western blot分析。结果表明,细胞内myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48 h分别下降了82.54%和90.02%,但采用RNAi显著下调MKK4基因表达后细胞内myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48 h只分别下降了40.42%和24.38%。本实验一方面进一步证实了JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞分化中发挥了重要的作用,另一方面为寻求下调Myostatin活性提供了有益的思路。总之,本研究首次揭示了Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的JNK信号途径。首先,本研究证实了C2C12细胞增殖和分化过程中Myostatin能够激活JNK信号途径。其次,本研究证实了Myostatin是通过ActRⅡB受体再通过TAK1-MKK4信号通路而激活JNK。最后,本研究证实了激活的JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化中发挥了重要作用。此外,本研究发现显著下调MKK4基因的表达能明显削弱Myostatin下调分化相关基因表达的能力,这为寻求下调Myostatin活性提供了有益的思路。
