背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)发生后,患者大量心肌细胞坏死,但是坏死的心肌无法进行修复,梗死区坏死的心肌组织被瘢痕组织代替,相应地心脏功能和形态将会发生改变,引发左室重构和扩大,并且可能会发展成为缺血性心肌病乃至充血血性心力衰竭。目前心力衰竭死亡率每年高达10%,5年生存率低于50%,己经成为危害人类健康的主要杀手。现有冠状动脉血运重建如药物、介入和外科手术等,虽能挽救缺血心肌,使患者死亡率显著下降至5%左右,但不能再生坏死心肌,急性心肌梗死仍是导致心力衰竭的主要病因(约占70% )。骨髓间充质干细胞是近些年来国内外利一学界关注的热点领域。骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多能干细胞,它们可以释放促进血管生成和抗凋亡的因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。骨髓间充质干细胞并且具有多向分化,自我增殖等能力。研究表明骨髓间充质干细胞移植可以激活内源性的修复机制,对损伤的组织、器官进行修复。心肌内移植骨髓间充质干细胞能修复心肌细胞、改善心肌灌注和心功能、阻止心室重塑。细胞移植后的细胞存活数量与治疗效果密切相关,而移植细胞要面对的是受损器官和组织由于缺血、炎症反应和促凋亡因子等因素所形成的恶劣微环境。因此,骨髓间充质干细胞在宿主中极低的生存率限制了其治疗作用。目前,主要有3种方法用于促进骨髓间充质干细胞在宿主中的存活:①改善宿主的组织环境从而利于骨髓间充质干细胞的存活;②对移植细胞进行预处理;③基因修饰骨髓间充质干细胞。人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根及根茎,具有多种功效。秦汉时代的《神农本草经》将其列为药中上品。其属名“Panax”源自希腊语,“Pan”意为“全部”,“axos”意为“治愈”,“Panax”可逐字翻译为治疗全部疾病或是万灵药。现代的研究也已经证实人参的主要活性成份可能是人参皂苷(ginsenosides)。每一个人参皂苷因其具有不同的结构相应的具有不同的药理作用及作用机制,迄今为止,已经有大约40余种人参皂苷被发现,而其分离、分析的方法也早已成熟。人参皂苷的药理作用被人们普通认为可以代表人参的药理作用,包括扩张血管,抗炎,抗氧化和抗肿瘤等,其中以Rb1, Rg1, Rg3, Re,和Rd研究最为深入。人参含有2%-3%的人参皂苷,在数量上分别以Rg1, Rc, Rd, Re, Rb1, Rb2,和Rb0为最多。人参皂苷结构的共同特点是一个4环,并和糖基相连的类固醇样结构,每一个人参皂苷至少有2个(C-3和C-20)羟基或者3个羟基(C-3,C-6和C-20),而其羟基或是游离,或是与单糖、双糖以及三糖相连,人参皂苷也可以凭借C-20上羟基的位置作为一个立体异构体存在。按照化学结构的不同,人参皂苷可大体地分为二种:原人参萜二醇(protopanaxadiols, PD)和原人参萜三醇(protopanaxatriols,PT),原人参萜二醇包括Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh2,和Rh3,原人参萜三醇包括Re, Rf, Rg1, Rg2和Rh1。人参皂苷属于二性分子团,它的羟基可以和膜磷脂的极性头与类固醇的β-羟基相互结合,而它的疏水性类固醇主链也可以和脂肪酸与胆固醇的侧链疏水基团相互相合,因此人参皂苷能和许多的膜蛋白,包括离子通道,转运体和受体相结合,这也是其具有广阔的药理作用的原因。人参皂苷可以抑制活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的产生,促进一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生,增加免疫功能,改善神经系统功能和预防心脏病等药理作用和保健功能。人参在我国已有上千年的使用历史,至今仍然在临床中被广泛使用。近几十年来人参在西方国家使用范围逐渐扩大。美国的一项调查表明,年龄在45～64岁的人群,估计约有4%～6%的人在使用人参;加拿大的调查表明约6%的心血管患者在使用人参。独参汤是以人参单味入药的古老方剂,具有大补元气,复脉固脱的功效。独参汤是否可以影响骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死,目前尚未见相关报道。目的:1.制作独参汤颗粒剂,保证实验过程中中药的质量可控;2.完成大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、传代,筛选独参汤促进骨髓间充质干细胞增殖的影响的最佳浓度,在体外研究独参汤对骨髓间充质干细胞抗氧化应激的能力,研究在H2O2刺激下,独参汤对骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响;3建立大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的模型,探讨独参汤对骨髓间充质干细胞移植治疗AMI的影响,探讨独参汤是否可以影响移植细胞的存活,评价独参汤可能对大鼠心梗后心脏形态、结构及功能的影响。方法:1.在依照国家药典的相关规定并参考中医文献,制作独参汤(即人参水提取物),并制作成颗粒剂,利用高效液相方法检测药品的人参皂苷含量,比较独参汤与其颗粒剂是否含有相同的药物成份,并对颗粒剂的粒度,可溶性等进行相关检测;2.用密度梯度离心法分离雄性Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、用相差显微镜观察其形态,取第5代骨髓间充质干细胞,MTT法筛选独参汤促进骨髓间充质干细胞增殖的最佳浓度梯度,台盼蓝染色法观察独参汤对骨髓间充质干细胞在氧化应激条件下生存率的影响,ELISA方法检测独参汤对骨髓间充质干细胞分泌VEGF的影响;3.雌性Wistar大鼠54只,体重(250±50克),建立急性心肌梗死模型。随机分为4组:①急性心肌梗死对照组(AMI, n=10):大鼠心肌梗死后注射等量培养基;②干细胞组(AMI+ rBMSCs, n=12):急性心肌梗死大鼠接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(2×106 BMSCs /100 u1,分4点注入);③独参汤组(AMI+独参汤, n=10):大鼠心肌梗死后注射等量培养基,急性心肌梗死后2小时开始灌服独参汤,每日二次,共用一周;④急性心肌梗死+干细胞移植组+独参汤组(AMI+rBMCs, n=12):大鼠急性心肌梗死后接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(2×106 BMSCs /100 u1,分4点注入),2小时后开始灌服独参汤,每日二次,共用一周。同步记录心电图变化,术后四天RT PCR检测体内干细胞存活,术后4周行超声检测心功能变化,Wester-blot检测VEGF在心肌内的分泌,心脏标本行HE染色。结果:1.独参汤与独参汤颗粒剂二者所含的有效成份完全相同,颗粒剂加工过程中未造成独参汤有效成份的损失。独参汤颗粒剂可溶性,含水量,微生物数,重金属含量符合国家相关规定。2.成功分离、培养出大鼠骨髓间充质干细胞,原代细胞接种2天后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。独参汤颗粒剂浓度在0.625,0.3125,0.156,0.078,0.039,0.0195mg/mL浓度时均可以促进骨髓间充质干细胞在体外的增殖。当独参汤颗粒剂在浓度为0.078mg/mL时,其促进骨髓间充质干细胞增殖的作用最强;在氧化应激条件下,独参汤可以减轻骨髓间充质干细胞受到的损害,其死亡率显著低于对照组,其中以独参汤浓度为0.0781mg/mL的保护作用最为明显,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。在H2O2刺激下,骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能被独参汤(浓度为0.0781mg/mL)强化,其分泌的VEGF其分泌较单纯骨髓间充质干细胞增加了近1倍,差异明显(P<0.05)。3.成功制备大鼠急性心肌梗死模型,结扎冠状动脉前降支后,心电图示ST段抬高,并时常伴有室性心律失常;术后四天干细胞组和独参汤+干细胞组动物的心肌梗死区域均可检测到sry,其中独参汤+干细胞组光密度(OD)值较干细胞组有显著差异(P<0.05)。术后四周干细胞组、独参汤组和干细胞+独参汤组术后各项参数较心肌梗死对照组比较均有提高;其中干细胞组和干细胞+独参汤组各项参数明显高于心肌梗死对照组,且具有显著性差异(P<0.05 ),而又以干细胞+独参汤干预组对心肌梗死后的心脏泵血功能改善为最佳。干细胞组、独参汤+干细胞组心肌内VEGF表达较心梗对照组和独参汤组显著增高(P<0.01),独参汤+干细胞组较干细胞组亦显著增高(P<0.05)。HE染色提示结缔组织增生,淋巴细胞聚焦,其中独参汤+干细胞组的病理损害为最轻。结论:1.独参汤颗粒剂完全可取代独参汤,供科研、临床使用,具有服用方便,易于保存,以及质量可控的明显优势。2.独参汤颗粒剂在体外可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,减轻氧化应激反应对骨髓间充质干细胞的损害,强化骨髓间充质干细胞分泌VEGF。3.独参汤颗粒剂可以强化骨髓间充质干细胞心肌内移植治疗心肌梗死的疗效,提高骨髓间充质干细胞在宿主体内的存活。
