目的研究死亡受体途径介导的凋亡与成人脂肪基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)体外诱导分化为星形胶质细胞反应过程的关系,以发现一个更好的环境适宜诱导后的星形胶质细胞生长,使它的数量有所增加,并且存活的周期变长,这对临床治疗具有重要的意义。方法将所得到的成人皮下脂肪组织借阅叶长青以及Zuk等的实验步骤进行操作,对其消化、培养成为脂肪基质细胞,记录观察镜下脂肪基质细胞每天的形态学变化。将生长情况较好的传至第2、3代的脂肪基质细胞,用诱导剂将其在体外进行诱导成为星形胶质细胞,在诱导后的细胞出现明显的形态学变化的时间点分组,分为诱导后48h、7d、14d和21d,并记录其形态学变化的特征。定性及定量检测脂肪基质细胞及诱导分化后的各个组的星形胶质细胞的特异性标志蛋白GFAP,以及死亡受体途径中受体和配体蛋白的表达情况。应用细胞流式法Annexin/PI双染来检测未诱导组及诱导后各个时间点的细胞的早期凋亡率,晚期凋亡率和细胞存活率等。用MTT法检测各组的星形胶质细胞的生长存活状态。记录得到的实验数据应用Excel 2007数据库储存整理,用统计软件系统SPSS13.0来统计分析所有的数据,连续变量采用均数±标准差((?)±s)表示,诱导前后各组间的比较采用单因素方差分析。以P<0.05(双侧)作为差异有统计学意义。结果分离培养的24h的原代细胞已经完全贴壁生长,在镜下可以见到形态多种多样的细胞,可呈不规则形、类圆形、长或短梭形。到第10d时,可见大量形状趋于一致的长梭形细胞排列成漩涡状生长。诱导后第48h时,发现细胞的折光性有所增强,有一些细胞的胞体周围可见伸出细而长的有分支的突起。在诱导第7d,可以见到细胞出现星形胶质细胞所具有的典型的形态,如胞体呈圆形或椭圆形,有细长的突起并出现较多分支交织成网状。在14d时,细胞的折光性较7d时增强但其形态无明显变化。到21d时,细胞的形态已明显不如14d,突起变少、变短,细胞的数量也明显减少。用免疫细胞化学法对因子进行定性检测的结果显示在未诱导的脂肪基质细胞中GFAP未出现阳性表达,而在诱导后的各组中都可以检测到阳性表达的细胞,而且在整个细胞体及突起部位都可以见到阳性表达的颗粒,仅在7d和14d之间其阳性表达率无明显差异(P>0.05),并且在诱导反应的第7d出现高峰期。Fas/FasL、TNFR1/TNFα、DR5/TRAIL、caspase3和caspase8在未诱导的脂肪基质细胞组和诱导后各组均可见细胞阳性表达,细胞浆为最主要的阳性表达部位,以胞核周围为著,而在突起部位较少见到的阳性表达。Fas和FasL的细胞阳性表达率在7d时进入高峰期,而与14d组无统计学差异(P>0.05)。TNFR1和TNFα的细胞阳性表达率随诱导时间的延长而逐渐增高,至21d时达到高峰期,且各组间之间均有明显的统计学差异性(P<0.05)。DR5细胞阳性表达率在第7d组达高峰,除48h与21d组其余各组之间有统计学差异(P<0.05)。TRAIL细胞阳性表达率在第7d组达到高峰期,各组间均有明显统计学差异(P<0.05)。Caspase8的细胞阳性表达率随着诱导时间而逐渐增高,在21d时达到最高峰期,除未诱导组和48h其余各组间均有明显的统计学差异(P<0.05)。Caspase3的细胞阳性表达率在第7d组达到高峰期,仅21d与48h之间无统计学差异(P>0.05)。Westernblotting结果显示GFAP的表达水平在诱导反应的第7d达到高峰值,仅7d与14d无统计学差异(P>0.05)。Fas和FasL的表达水平在第7d达到高峰值,仅7d与14d无统计学差异(P>0.05)。TNFR1和TNFα的表达水平随着诱导时间的延长而逐渐增高且各时间组间均有统计学差异(P<0.05),在21d组时达到高峰值。DR5的表达水平在第7d时达到高峰值且明显高于14d组(P<0.05)。TRAIL的表达水平在各组间均有明显的统计学差异,在第7d组进入高峰期。Caspase8的表达水平在各时间组之间均有明显的统计学差异(P<0.05)并随着诱导时间的延长而逐渐增高,在21d组时达到高峰值。Caspase3的表达水平在第7d时达到高峰值且明显高于14d组(P<0.05)。检测细胞存活状态的流式细胞术的结果显示,细胞存活率在诱导反应的整个过程中是随着诱导时间的延长而趋于下降,细胞的早期凋亡率和晚期凋亡以诱导时间的变化而趋于升高,细胞坏死率在各组之间无明显统计学差异。MTT的结果显示,细胞的存活数量以诱导时间的变化而趋于下降。结论死亡受体信号传导途径是ADSC诱导分化为星形胶质细胞过程中介导细胞凋亡的重要通路,特别是TNFR1/TNFα途径。虽然Fas/FasL和DR5/TRAIL信号传导通路在7d以前同样是引发细胞凋亡的重要信号传导通路,到14d时其作用明显减弱。DR5/TRAIL途径在7d时立即就明显减弱,没有出现明显高峰平台期。
