PPV和PCV2核酸疫苗及PRV-PPV-PCV2基因工程疫苗的研究

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猪细小病毒(Porcine Parvovims, PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2, PCV2)引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为代表的系列疾病。该两种疾病在世界范围内广泛流行,造成了巨大的经济损失,目前,对这两种疾病的防制主要靠预防接种。然而,目前广泛使用的猪细小病毒灭活疫苗存在灭活不完全的风险,而且由于PPV体外培养较困难,病毒增殖滴度较低,这给灭活疫苗的生产带来一定困难;同时PCV2在细胞上增殖滴度很低,发展传统疫苗都存在一定障碍,因此有必要发展新型疫苗来防制这两种疾病。这两种疾病常发生混合感染,并具有协同性,如果能研发一种可同时预防这两种疾病的疫苗,将具有重要意义。据此,本研究展开了对四川省PPV和PCV2的抗原流行病学调查,以掌握其流行现状;对PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因及其串联基因设计核酸疫苗;并以猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)为活病毒载体,构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗,为进一步预防和控制PRV、PPV和PCV2及其混合感染打下坚实的基础。具体如下:1.四川省猪细小病毒、猪圆环病毒2型流行病学调查从四川省21个规模化猪场共采集273份样品,通过PCR诊断技术进行了PPV、PCV2病原流行病学调查,结果检出PPV抗原阳性样品47份(17.22%)、PPV阳性猪场8个(38.1%),具有种猪的感染率较高,而在仔猪感染率相对较低的特点:检出PCV2抗原阳性样品143份(52.38%)、PCV2阳性猪场18个(85.7%),具有PCV2感染随猪年龄的增长而升高的趋势;检出PPV和PCV2混合感染样品29份(10.62%)、同时混合感染PPV和PCV2的猪场6个(28.7%),混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。2.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建通过PCR方法扩增PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因,并分别插入真核表达载体pCI-neo中,成功构建了真核表达质粒pCI-VP2和pCI-ORF2,同时,将PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因进行串联,两基因间以高亲水性氨基酸(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸连接,插入到PCI-neo中构建真核表达质粒pCI-VP2-ORF2。将pCI-VP2. pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2转染Vero细胞后,通过RT-PCR法检测目的基因转录、SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析蛋白表达,结果表明,3种真核表达质粒转染哺乳动物细胞后,既可扩增到目的基因,也可检测到特异性蛋白的表达,成功地表达了外源基因。3.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗对小鼠免疫效果研究将84核酸疫苗pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2以100μg/只剂量免疫健康昆明小白鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,于首免后O d、7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、56 d断尾采血并分离血清进行抗体检测,发现首免后14d,可检测到PPV和PCV2特异性抗体的出现,加强免疫后7d,其抗体转化为阳性,但其诱导抗体水平均低于疫苗组所诱导的抗体水平:于首免后0 d、21 d、56 d分离血清进行细胞因子检测,发现其均可诱导较高水平的IL-2、IL-4、IFN-y;于首免后56d,采集抗凝血一份,进行T淋巴细胞亚群检测,发现CD4+/CD8+比例明显下降;首免后56d在每组随机挑选一只小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏制备单个脾细胞悬液,用ConA进行刺激并测定刺激指数,发现能够诱导较强的脾细胞增殖;首免后56d采集小鼠的实质器官,进行安全性检测,均未检测到3种核酸疫苗的外源基因与小鼠基因组DNA整合的情况,表明3种核酸疫苗是安全的。这些结果说明,3种核酸疫苗均能够诱导小鼠产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答,并具有良好的安全性。4. PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建将VP2-ORF2融合基因从真核表达载体pCI-VP2-ORF2切下,连接到PRV通用转移载体pPI-2.EGFP中,成功构建了转移载体pPI-2.EGFP-VP2-ORF2。将PRV SA215基因组DNA与转移质粒pPI-2.EGFP-VP2-ORF2共转染Vero细胞,通过同源重组,构建重组病毒。挑斑筛选后,通过绿色荧光检测和PCR检测表明成功构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗株PRV SA215 (Dl);通过SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析,结果表明,VP2基因和ORF2基因在重组PRV SA215 (D1)获得了成功表达,融合蛋白具有良好的免疫反应原性。5. PRV SA215(D1)部分生物学特性研究将PRV SA215(D1)接种Vero细胞,观察其致病变效应、重组病毒的形态,测定一步法生长曲线,结果表明,外源PPV VP2和PCV2 ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖和病毒粒子的包装。将PRVSA215(D1)在Vero细胞上连续传6代,未发现PPV VP2和PCV2 ORF2基因丢失,表明PRV SA215(D1)具有遗传稳定性。将PRVSA215(D1)以104PFU剂量免疫健康昆明小鼠,发现其对小鼠有良好的安全性,以104PFU免疫小白鼠可对106 PFU PRV Fa株强毒攻击产生完全保护。将PRVSA215(D1)以105PFU剂量免疫仔猪,可引起仔猪外周血CD4+T淋巴细胞阳性细胞数明显提高,CD8+T淋巴细胞阳性细胞数相对减少;可诱导产生较高水平的细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,表明能够显著的增强Thl和Th2型免疫应答;可诱导仔猪产生较高水平的PRV、PPV和PCV2的抗体,其中PRV水平抗体与其亲本株PRV SA215相当,PPV和PCV2抗体水平略低于灭活疫苗组;这些结果表明,PRV SA215(D1)可望作为预防控制PRV、PPV和PCV2的三价基因工程疫苗候选株。
中文摘要第13-16页
Abstract第16-18页
第一章 文献综述第19-39页
    1 猪细小病毒研究概述第19-26页
        1.1 猪细小病毒病的发生与流行特点第19-20页
        1.2 猪细小病毒病原学第20-23页
            1.2.1 病毒特性第20-21页
            1.2.2 猪细小病毒基因组结构第21-22页
            1.2.3 基因组产物第22-23页
        1.3 猪细小病毒病疫苗研究进展第23-26页
            1.3.1 灭活疫苗第23-24页
            1.3.2 弱毒疫苗第24页
            1.3.3 新型疫苗第24-26页
    2 猪圆环病毒概述第26-34页
        2.1 猪圆环病毒病的发生与流行特点第26-27页
        2.2 猪圆环病毒病原学第27-31页
            2.2.1 猪圆环病毒病原特性第27-28页
            2.2.2 猪圆环病毒基因组结构第28-29页
            2.2.3 猪圆环病毒基因组产物第29-31页
        2.3 PCV2与免疫的关系第31页
        2.4 猪圆环病毒疫苗研究进展第31-34页
            2.4.1 PCV灭活疫苗第32页
            2.4.2 PCV弱毒疫苗第32-33页
            2.4.3 核酸疫苗第33页
            2.4.4 重组活载体疫苗第33-34页
            2.4.5 其他第34页
    3. 核酸疫苗研究进展第34-35页
    4. 伪狂犬病毒载体研究进展第35-37页
    5. 本文研究的目的和意义第37-39页
第二章 四川省PPV与PCV2病原流行病学调查第39-47页
    1 试验材料与方法第39-41页
        1.1 实验材料第39页
        1.2 主要仪器第39-40页
        1.3 样品的收集第40页
        1.4 样品的处理第40页
        1.5 检测方法第40-41页
    2. 实验结果第41-44页
        2.1 总体阳性率第41-42页
        2.2 各生产阶段阳性率第42-43页
        2.3 猪场阳性率第43-44页
    3. 讨论第44-46页
    4 小结第46-47页
第三章 PPV和PCV2核酸疫苗的构建第47-69页
    1 材料与方法第47-57页
        1.1 质粒、菌株及细胞第47页
        1.2 主要试剂及药品第47页
        1.3 主要仪器第47-48页
        1.4 真核表达载体PCI-VP2的构建第48-51页
            1.4.1 质粒pMD-VP2的小量制备第48-49页
            1.4.2 PPV VP2基因亚克隆第49-50页
            1.4.3 真核表达载体pCI-VP2的构建第50-51页
        1.5 真核表达载体PCI-ORF2的构建第51-53页
            1.5.1 质粒pMD-ORF2的小量制备第51页
            1.5.2 PCV2 ORF2基因亚克隆第51-52页
            1.5.3 真核表达载体pCI-ORF2的构建第52-53页
        1.6 真核表达载体pCI-VP2-ORF2的构建第53-54页
            1.6.1 质粒pCI-VP2和pCI-ORF2的小量制备第53页
            1.6.2 pCI-VP2和ORF2基因的酶切与回收第53页
            1.6.3 连接与转化第53页
            1.6.4 重组质粒的酶切鉴定第53-54页
            1.6.5 重组质粒的PCR鉴定第54页
            1.6.6 重组质粒的序列测定第54页
        1.7 重组质粒转染VERO细胞第54-55页
            1.7.1 pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2质粒DNA的抽提第54页
            1.7.2 pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2质粒DNA的转染第54-55页
        1.8 重组质粒表达分析第55-57页
            1.8.1 真核表达转录RT-PCR检测第55页
            1.8.2 SDS-PAGE及Western blotting分析第55-57页
            1.8.3 间接免疫荧光检测第57页
    2. 实验结果第57-65页
        2.1 真核表达载体pCI-VP2的构建第57-58页
            2.1.1 PPV VP2基因的PCR扩增第57-58页
            2.1.2 pMD-VP2(A)的酶切鉴定第58页
            2.1.3 pCI-VP2的酶切鉴定第58页
        2.2 真核表达载体PCI-ORF2的构建第58-60页
            2.2.1 PCV2 ORF2基因的PCR扩增第58-59页
            2.2.2 pMD-ORF2(A)的酶切鉴定第59页
            2.2.3 pCI-ORF2的酶切鉴定第59-60页
        2.3 真核表达载体PCI-VP2-ORF2的构建第60-62页
            2.3.1 pCI-VP2-ORF2的酶切鉴定第60页
            2.3.2 重组质粒的PCR鉴定第60页
            2.3.3 重组质粒的序列测定第60-62页
        2.4 重组质粒表达分析第62-65页
            2.4.1 真核表达转录RT-PCR检测第62页
            2.4.2 SDS-PAGE与Western blotting分析第62页
            2.4.3 间接免疫荧光检测第62-65页
    3. 讨论第65-68页
        3.1 核酸疫苗的设计第65-66页
            3.1.1 目的基因的选择第65-66页
            3.1.2 表达载体的选择第66页
        3.2 重组质粒的构建策略第66-67页
            3.2.1 融合基因的设计第66-67页
            3.2.2 重组构建技术第67页
        3.3 关于表达第67-68页
    4. 小结第68-69页
第四章 PPV和PCV2核酸疫苗对小鼠免疫效果研究第69-84页
    1 材料与方法第69-75页
        1.1 质粒和实验动物第69页
        1.2 主要试剂及药品第69页
        1.3 主要仪器第69-70页
        1.4 质粒DNA的大量抽提与纯化第70页
        1.5 质粒DNA的免疫第70页
        1.6 T淋巴细胞数量的动态变化检测第70-71页
        1.7 脾淋巴细胞增殖反应(MTT比色法)第71页
        1.8 抗体检测第71-72页
            1.8.1 PPV抗体检测第71-72页
            1.8.2 PCV2抗体检测第72页
        1.9 细胞因子检测第72-73页
            1.9.1 IL-2检测第72-73页
            1.9.2 IL-4检测第73页
            1.9.3 IFN-γ检测第73页
        1.10 重组质粒安全性研究第73-74页
        1.11 统计学分析第74-75页
    2. 实验结果第75-79页
        2.1 T淋巴细胞数量的动态变化检测第75页
        2.2 脾淋巴细胞增殖反应的检测(MTT比色法)第75-76页
        2.3 抗体水平检测第76-78页
            2.3.1 PPV抗体检测第76-77页
            2.3.2 PCV2抗体检测第77-78页
        2.4 细胞因子检测第78-79页
            2.4.1 IL-2检测第78页
            2.4.2 IL-4检测第78-79页
            2.4.3 IFN-γ检测第79页
        2.5 重组质粒安全性研究第79页
    3. 讨论第79-83页
        3.1 核酸疫苗对小鼠免疫效力的研究第79-80页
        3.2 核酸疫苗的免疫途径与剂量第80-81页
        3.3 细胞免疫应答第81页
        3.4 体液免疫应答第81-82页
        3.5 核酸疫苗的安全性第82-83页
    4. 小结第83-84页
第五章 PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建第84-99页
    1 材料与方法第85-91页
        1.1 质粒、菌株及细胞第85页
        1.2 主要试剂及药品第85页
        1.3 主要仪器第85页
        1.4 质粒PCI-VP2-ORF2的小量制备第85-86页
        1.5 PPI-2.EGFP.VP2.ORF2的构建第86页
            1.5.1 质粒pPI-2.EGFP与pCI-VP2-ORF2的酶切回收第86页
            1.5.2 连接与转化第86页
        1.6 重组质粒的鉴定第86-87页
            1.6.1 重组质粒的酶切鉴定第86-87页
            1.6.2 重组质粒的PCR鉴定第87页
            1.6.3 重组质粒的序列测定第87页
        1.7 PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建第87-89页
            1.7.1 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2质粒DNA的抽提第87-88页
            1.7.2 PRV SA215病毒DNA的抽提第88-89页
            1.7.3 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2质粒与PRV SA215 DNA共转染Vero细胞第89页
        1.8 重组病毒的筛选第89-90页
        1.9 重组病毒表达分析第90-91页
            1.9.1 SDS-PAGE及Western blotting分析第90页
            1.9.2 间接免疫荧光分析第90-91页
    2. 实验结果第91-94页
        2.1 PPI-2.EGFP.VP2.ORF2的鉴定第91-92页
            2.1.1 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的酶切鉴定第91页
            2.1.2 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的PCR鉴定第91-92页
            2.1.3 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的序列测定第92页
        2.2 重组PRV SA215(D1)的构建与筛选第92-93页
        2.3 重组PRV SA215(D1)的PCR鉴定第93页
        2.4 PRV SA215(D1)的表达分析第93-94页
            2.4.1 SDS-PAGE及Western blotting分析第93-94页
            2.4.2 间接免疫荧光分析第94页
    3. 讨论第94-98页
        3.1 伪狂犬病病毒载体的优越性第94-96页
        3.2 重组病毒PRV SA215(D1)的构建第96-97页
        3.3 外源基因在伪狂犬病病毒载体中的表达第97-98页
    4. 小结第98-99页
第六章 PRV SA215(D1)部分生物学特性研究第99-115页
    1 材料与方法第99-103页
        1.1 细胞、疫苗和实验动物第99页
        1.2 主要试剂及药品第99-100页
        1.3 主要仪器第100页
        1.4 PRV SA215(D1)在VERO细胞上的致病效应观察第100页
        1.5 蚀斑试验第100页
        1.6 一步生长曲线测定第100页
        1.7 PRV SA215(D1)与亲本毒株SA215形态学比较第100页
        1.8 PRV SA215(D1)的遗传稳定性检测第100-101页
        1.9 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性与免疫保护试验第101页
            1.9.1 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性试验第101页
            1.9.2 PRV SA215(D1)对小鼠的免疫保护试验第101页
        1.10 PRV SA215(D1)对仔猪的免疫性实验第101-103页
            1.10.1 试验分组第101页
            1.10.2 外周T淋巴细胞亚群数量的检测第101-102页
            1.10.3 PRV、PPV、PCV2抗体检测第102页
            1.10.4 细胞因子检测第102-103页
    2 试验结果第103-112页
        2.1 PRV SA215(D1)在VERO细胞上的致病效应观察第103-104页
        2.2 噬斑形态观察第104-105页
        2.3 一步生长曲线测定第105页
        2.4 PRV SA215(D1)与亲本毒株PRV SA215形态学比较第105-106页
        2.5 PRV SA215(D1)的遗传稳定性检测第106-107页
        2.6 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性与免疫保护第107页
            2.6.1 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性试验第107页
            2.6.2 PRV SA215(D1)对小鼠的免疫保护试验第107页
        2.7 PRV SA215(D1)对仔猪的免疫性实验第107-110页
            2.7.1 外周T淋巴细胞亚群数量的检测第107-108页
            2.7.2 PRV抗体检测第108-109页
            2.7.3 PPV抗体检测第109页
            2.7.4 PCV2抗体检测第109-110页
        2.8 细胞因子检测第110-112页
            2.8.1 IL-2检测第110-111页
            2.8.2 IL-4检测第111页
            2.8.3 IFN-γ检测第111-112页
    3. 讨论第112-114页
        3.1 重组病毒PRV SA215(D1)的培养增殖特性第112-113页
        3.2 安全性试验第113页
        3.3 PRV SA215(D1)对仔猪的免疫效果第113-114页
    4. 小结第114-115页
本研究的创新之处第115-116页
参考文献第116-126页
致谢第126-127页
个人简介第127-128页
攻读学位期间发表的学术论文目录第128页
论文购买
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