泰山虫草多基因分子系统学研究

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虫草属隶属麦角菌科(Clavicipitaceae)、肉座菌目(Hypocreales)、核菌纲(Pyrenomucetes)、子囊菌门(Ascomycota),广布于全世界。最新的分类学将其分为三个科虫草科(Cordycipitaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、蛇形虫草科(Ophiocordycipitaceae)四个属(Cordyceps、Metacordyceps、Elaphocordyceps、Ophiocordyceps)。本文主要以野生泰山虫草的子实体为材料,以Tef-1α、β-tub、nrSSU、nrLSU基因的部分序列和rDNA ITS序列为分子标记,运用同源性分析、系统进化分析、遗传距离分析等方法探讨泰山虫草的分类地位以及与其它虫草的亲缘关系,并对功能基因进行ORF分析,以期为泰山虫草的开发与应用提供相关的理论依据。主要结果如下:1.以泰山虫草基因组DNA为模板,用虫草通用引物和一条新设计的引物扩增出五个目的片段,经回收、克隆、测序后提交到NCBI数据库,得到的登录号分别为:β-tub(JN547406)、Tef-1α(JN547405)、nrSSU-ITS-nrLSU(JN411084),2012年10月以后释放。2.以Tef-1α、β-tub、nrSSU、nrLSU、rDNA ITS序列为分子标记,分别进行同源性分析,结果表明泰山虫草、九州虫草、蛹虫草三者之间相似性在99%以上,据此难以区分哪两者之间的亲缘关系更近;单基因系统进化分析结果也显示这三种虫草始终聚在一起。提示了这三者之间在分类地位上的一致性,应同归为虫草科。3.以Tef-1α、β-tub、nrSSU、nrLSU为分子标记进行的遗传距离分析结果显示泰山虫草和九州虫草的亲缘关系更近,两者之间的遗传距离和标准误差均为0.000;nrSSU-nrLSU-Tef-1α三基因综合数据的系统进化分析结果表明泰山虫草和九州虫草始终聚在一起,然后与蛹虫草聚在一起。结合同源性分析结果,可以推断泰山虫草和九州虫草为同物异名。4.运用光学显微镜及石蜡切片技术对泰山虫草子实体的显微结构进行观察,并对其表面结构进行电子显微镜扫描观察。结果显示,供试材料子囊壳的排列方式和包埋情况与文献所描述的九州虫草和蛹虫草均很相似,也提示了这三种虫草在分类学上关系较近,与分子生物学得到的结果相一致。
摘要第3-4页
Abstract第4页
第一章 文献综述第8-14页
    1.1 分子标记技术第8-9页
        1.1.1 分子标记的概念第8页
        1.1.2 核糖体 DNA 作为分子标记的依据第8页
        1.1.3 新型分子标记的选择第8-9页
    1.2 虫草分类研究第9-11页
    1.3 虫草的生长繁殖第11-12页
    1.4 虫草的化学成分及生理功能第12页
        1.4.1 虫草化学成分第12页
        1.4.2 虫草生理功能第12页
    1.5 虫草的无性型研究第12页
    1.6 泰山虫草研究现状第12-13页
        1.6.1 泰山虫草概述第12页
        1.6.2 泰山虫草生长环境第12页
        1.6.3 泰山虫草的化学成分第12-13页
        1.6.4 泰山虫草的生理功能第13页
        1.6.5 人工培养第13页
    1.7 本研究的目的和意义第13-14页
第二章 材料与方法第14-22页
    2.1 实验材料第14页
    2.2 仪器和药品第14-15页
        2.2.1 实验仪器第14页
        2.2.2 主要试剂第14页
        2.2.3 主要溶液的配制第14-15页
    2.3 方法第15-22页
        2.3.1 虫草的形态学研究第15页
        2.3.2 虫草总基因组 DNA 的提取及检测第15-16页
        2.3.3 目的片段的扩增及电泳检测第16-17页
        2.3.4 目的片段的回收第17页
        2.3.5 感受态细胞的制备第17页
        2.3.6 筛选平板的制备第17页
        2.3.7 连接、转化、涂平板第17-18页
        2.3.8 菌体 PCR 鉴定阳性重组子第18页
        2.3.9 序列的注册第18页
        2.3.10 序列分析第18-19页
        2.3.11 系统进化分析第19-20页
        2.3.12 同源性分析第20-21页
        2.3.13 功能基因的 ORF 分析第21-22页
第三章 实验结果与分析第22-42页
    3.1 虫草的形态观察第22页
    3.2 虫草基因组 DNA 的质量及纯度检测第22-23页
    3.3 目的片段的扩增及菌体 PCR 检测第23-24页
    3.4 测序结果评估及序列注册结果第24页
    3.5 碱基组成分析第24-25页
    3.6 遗传距离分析第25-27页
    3.7 单基因系统进化分析第27-31页
        3.7.1 最大简约法(MP)分析第27-29页
        3.7.2 邻接法(NJ)聚类分析第29-31页
    3.8 nrSSU-nrLSU- Tef-1α 三基因系统进化分析第31-33页
    3.9 同源性分析第33-36页
    3.10 结论第36页
    3.11 功能基因的 ORF 分析第36-41页
        3.11.1 β-tub 基因的 ORF 分析第36-39页
        3.11.2 Tef-1α基因的 ORF 分析第39-41页
    3.12 小结第41-42页
第四章 讨论第42-44页
    4.1 泰山虫草与九州虫草似为同物第42页
    4.2 不同系统发育分析方法的应用第42页
    4.3 基因组 DNA 提取方法的改进第42-44页
参考文献第44-50页
致谢第50-51页
在读期间发表和完成的论文第51页
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