水稻绒毡层细胞程序性死亡调控育性的分子机理研究

水稻是重要的粮食作物,同时也是单子叶植物尤其是禾谷类作物研究的模式植物。随着水稻全基因组序列测序的完成和不同水稻品种深度测序的相继展开,水稻功能基因组的研究进入一个新的阶段。大规模的T-DNA插入失活突变体成为水稻功能基因组研究的重要平台之一。本研究通过筛选本室构建的水稻T-DNA插入突变体库,得到一个突变表型为雌雄不育的突变体osapi5-1,且突变表型和T_DNA插入共分离。对osapi5-1突变体的细胞学和组织化学分析结果显示造成雄性不育的原因是花药绒毡层PCD过程受到抑制,使绒毡层的降解受到部分抑制和推迟,最终导致花粉的败育。雌性不育的原因是减数分裂后形成的功能大孢子由于未知的原因降解,最终导致osapi5-1突变体胚囊的败育。功能互补试验和RNAi抑制结果确定OsAPl5基因的功能失活导致osapi5-1的雌雄不育。OsAPI5基因编码一个注释为细胞凋亡抑制因子5(Apoptos isinhibitor 5)的具有转录激活活性的核蛋白,进化树显示这一类蛋白广泛的存在于原生生物、植物和动物中,是一个古老保守的蛋白家族,水稻基因组内只有一个拷贝的该类基因。QRT-PCR结果显示OsAPI5基因是一个组成型表达的基因,但是原位杂交的证据支持OsAPI5基因在花药绒毡层和胚囊中的表达是相对特异的。我们利用酵母双杂交的方法分离到OsAPI5的两个互作蛋白AIP1和AIP2(Api5 Interacting Protein).AIP1和AIP2是都编码433个氨基酸的蛋白,它们被注释为依赖于ATP的含有DEAD盒RNA解螺旋酶(Dead-box ATP-dependent RNA Helicase).AIP1和AIP2之间只有3个氨基酸的差异,且这些差异的氨基酸不影响AIP1和AIP2与OsAPI5之间的互作。随后我们利用荧光双分子互补试验(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)在体内和体外分别证实了AIP1和AIP2与OsAPI5之间的互作。QRT-PCR结果显示AIP1/2同样是组成型表达的基因。AIP1/2定位到拟南芥原生质体的细胞核和细胞质内。而二聚体化的AIP1/2特异的定位到拟南芥原生质体的细胞核内。利用人工微RNA(Artificial micro RNA)技术同时抑制AIP1/2也会使转基因植株产生不育的表型,而且造成不育的细胞学基础也是由于绒毡层推迟降解导致的。通过酵母缺失突变体的互补试验证实AIP1/2是酵母SUB2p的直向同源基因。为了研究OsAPI5-AIP1/2复合体参与的控制水稻雌雄不育的分子路径,我们分析了osapi5-1突变体和野生型之间的全基因组表达谱差异,与野生型相比,OsCP1基因在osapi5-1突变体中下降表达2倍以上,进一步用QRT-PCR重新验证了OSCP1基因在osapi5-1突变体和育性下降的AmiRNA-AIP1/2转基因植株中都是下降表达的。有研究报道显示OsCP1基因编码一个半胱氨酸蛋白酶,其下降表达会造成水稻的花药绒毡层推迟降解,进而导致水稻育性下降。随后,采用酵母单杂交的方法证实AIP1/2可以在酵母体内特异地结合到OsCP1基因的启动子区域。同时,凝胶阻滞(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)和染色质免疫共沉淀结果证实在体外和体内AIP1/2和OsCP1基因的启动子区域CP1-P-1之间的特异互作。综合以上结果,OsAPI5-AIP1/2复合体好像一个体内天然存在的“杂合”转录因子,通过结合到靶基因OsCP1基因的启动子区域,通过调控靶基因的表达控制育性。这些结果使我们能更深入的了解OsAPI5、AIP1/2和OsCP1基因的功能及其相互作用关系,为认识水稻育性控制的分子机理提供了重要的知识。