目的由于感染流感病毒而引发的呼吸道传染病简称为流感,每年季节性地发生流行。流感病毒的抗原在不同的温度、湿度、以及人体中容易发生变异,治疗起来往往滞后。化药有抗流感病毒的作用,但其毒副作用较强。因而,探索中医药宝库,寻找防治流感有效的药物,以及研发新型抗流感药剂,有重要的意义。黄芩性味苦寒,可清热燥湿、泻火解毒,凉血安胎,历代医籍中记载了黄芩及其配伍方剂治疗肺疾病的功效,现代临床治疗流感的方剂和制剂中黄芩也是常用的一味中药。为明确其抗病毒的作用机制,在体内实验研究的基础上进行体外实验。研究选用人流感病毒亚甲型H1N1,A1/黔防/166/85株,感染人肺癌上皮细胞株A549建立模型,观察中药单体黄芩苷对H1N1感染A549细胞的治疗作用以及其对免疫调节功能的影响。同时以固有免疫中的模式识别受体TLR (Toll样受体)为研究切入点,探讨黄芩苷体外抗病毒作用及发挥免疫调节作用的分子作用机制；以及黄芩苷对流感病毒感染细胞产生炎性因子以及凋亡相关因子的调控作用。同时采用基因芯片技术,研究细胞基因谱的差异基因表达,仔细分析筛选,找到黄芩苷发挥抗流感病毒作用的有关因子,为黄芩苷的临床应用提供明确的实验依据,以及新的抗流感病毒药物的筛选提供分子生物学基础。方法1.黄芩苷体外对流感病毒增殖作用方式的研究通过细胞病变效应(CPE)观察黄芩苷对病毒致细胞病变作用的影响。复苏细胞人肺腺癌上皮细胞A549,调整细胞浓度为每毫升1.5×105个铺板,根据病毒复制周期,设计3个药物抗病毒作用靶点：药物预防组(Ⅰ)、抗病毒生物合成组(Ⅱ)和抗病毒吸附组(Ⅲ)。分别加入100TCIDso病毒作用,在加入TC0下连续对倍稀释的五个浓度的用培养基稀释的黄芩苷药液,48小时后采用MTT法测定,并计算药物抑制病毒有效率。2.黄芩苷对流感病毒感染细胞相关基因表达作用的研究复苏细胞调整细胞浓度为每毫升1.5×105个铺板,分为正常细胞对照组(A),H1N1感染组(B),达菲对照组0.75μg·ml-1 (C),黄芩苷高剂量组3.96μg·ml-1(D),黄芩苷低剂量组0.99μg·ml-1(E)。除正常细胞对照组外,均加入100TCID50流感病毒H1N1吸附2h后,吸弃上清液,加入PBS清洗,再加入上述浓度的达菲和黄芩苷药物作用48h,吸弃去细胞上清,用预冷PBS清洗2次后,加入Tris-HCl裂解液,吹打三次,裂解液使得细胞变圆形,飘起,收集细胞裂解液至冻存管中,提取各组总RNA,采用基因组芯片对所有基因组进行分析讨论。3.黄芩苷对流感病毒诱导炎性细胞因子表达作用的研究将细胞分为正常细胞对照组(A),H1N1感染组(B),达菲对照组(C),黄芩苷高剂量组(D),黄芩苷低剂量组(E)。H1N1感染组(B),达菲对照组(C),黄芩苷高剂量组(D)和黄芩苷低剂量组(E)均使用流感病毒H1N1感染2h,弃掉病毒液,预冷PBS清洗2次后,加入对应的药物。加药作用48h,吸上清弃掉,加入细胞裂解液,收集细胞裂解液至EP管中,提取各组总RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定炎性细胞因子表达变化。4.黄芩苷对流感病毒感染细胞Toll受体信号通路调节作用的研究采用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染人肺癌上皮细胞A549后,细胞固有免疫模式识别受体TLR3/7信号通路中相关差异基因转录的变化。选用荧光定量PCR技术和WB法检测各组细胞中的Toll样受体3 (Toll-like receptor 3, TLR3), Toll样受体7(Toll-like receptor 7, TLR7),髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)的mRNA及蛋白表达的变化。5.黄芩苷对流感病毒感染细胞中NF-κB和MAPK-JNK信号通路作用的研究采用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后,细胞内NF-κB和MAPK-JNK信号通路中基因转录的变化。选用荧光定量PCR技术和Western blotting法检测各组细胞中的核因子Kappa B (nuclear factor-Kappa B, NF-κB),丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 8)的mRNA及蛋白表达的变化。6.黄芩苷对流感病毒感染细胞JAK-STAT信号通路作用的研究采用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染人肺癌上皮细胞A549后,细胞内JAK-STAT信号通路中差异基因转录的变化。选用荧光定量PCR技术和Western blotting法检测各组细干扰素y (interferon y, IFN-y),白介素10(IL1O)的mRNA及蛋白表达的变化。7.黄芩苷对流感病毒感染细胞Apoptosis信号通路作用的研究培养人肺腺癌上皮细胞A549,并与甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后,以达菲为阳性对照组,利用基因芯片技术研究黄芩苷对凋亡信号通路中基因转录的变化。同时,采用荧光定量PCR检测各组细胞中的肿瘤坏死因子受体超家族成员6(Fas)天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白3、8 (Caspase3.8)的mRNA表达的变化。Western blotting法检测各组细胞中相应因子的蛋白的变化。结果1.黄芩苷体外对流感病毒增殖作用方式的研究流感病毒H1N1的半数细胞感染率(TCIDso)为10-3.778／0.1 m1；黄芩苷的最大无毒浓度TCo为7.92μg·ml-1;半数毒性浓度TCso为31.62μg·ml-1。以三种方式给予五个不同浓度的黄芩苷,其中抗病毒生物合成组(Ⅲ)中各浓度对病毒感染的抑制率较高,最高抑制率达89.11%；黄芩苷在48小时抗病毒作用较高,黄芩苷组比病毒对照组滴定终点均明显提前。2.黄芩苷对流感病毒感染细胞相关基因表达作用的研究对黄芩苷组的差异基因进行GO term节点富集分析,并与模型组相比。依据P<0.05,且涉及的基因数分别为不小于70和40取GO节点,黄芩苷涉及免疫学方面的分子功能(MF)为：酶结合(enzyme binding),转录因子激活酶活性(transcription activator activity),RNA结合(RNA binding),蛋白质二聚体活性(protein dimerization activity)蛋白激酶活性(protein kinase activity),核苷酸结合(nucleotide binding),丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性(protein serine/threonine kinase activity),磷酸化调节活性(phosphatase regulator activity),小分子GT酶结合(small GTPase binding),腺嘌呤核苷酸结合(purine nucleoside binding)以及识别蛋白结合(identical protein binding)等方面的分子功能作用显著。黄芩苷主要调节的代谢途径(BP)有：DNA代谢过程(DNA metabolic process), RNA生物合成过程(RNA biosynthetic process), DNA损伤反应(response to DNA damage stimulus),染色体结构(chromosome organization),蛋白定位(protein localization),细胞内转运(intracellular transport),细胞对压力的反应(cellular response to stress),细胞器裂变(organelle fission), DNA损伤修复(DNA repair),磷酸代谢过程(phosphate metabolic process)细胞周期(cell cycle)和细胞有丝分裂周期(mitotic cell cycle)等方面的作用明显。黄芩苷主要调控的关于细胞成分(CC)为：核内腔(nuclear lumen),胞内细胞器腔(intracellular organelle lumen),核浆(nucleoplasm),腔上包膜(membrane-enclosed lumen),胞膜(envelope),细胞器腔(organelle lumen),染色体部分(chromosomal part),细胞内非包膜细胞器(intracellular non-membrane-bounded organelle)中心体(centrosome),内膜体系(endomembrane system)和细胞液(cytosol)等方面的有显著的作用。基于KEGG数据库,通过对差异基因筛选(P
