小麦蓝矮病植原体tengu基因的分离及致病性测定

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小麦蓝矮病(Wheat Blue Dwarf Disease,WBD)是我国首次报道的小麦植原体病害,国外未见报道,由条沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)专化性传播。该病害广泛分布于我国西北干旱、半干旱晚熟冬麦区。发生严重时可使全田绝收,给麦区粮食生产带来巨大损失。因此,对小麦蓝矮病的研究具有重大意义。由于植原体无法进行人工培养,在寄主体内含量低,导致对该病原微生物的研究受到一定限制。本论文对小麦蓝矮病植原体tengu基因进行了分离、生物信息学分析和原核表达载体构建,并构建了小麦蓝矮病植原体的tengu基因、免疫膜蛋白(immunodominant membrane protein gene, imp)基因和溶血素(hemolysin, hlyC)基因的植物病毒表达载体,验证这3个基因在本氏烟中表达后对本氏烟的影响,研究结果如下:(1)小麦蓝矮病植原体tengu基因的克隆:设计特异性引物,对采于陕西韩城的发病小麦的总DNA进行扩增,分离到了tengu基因。应用DNAMAN软件与洋葱黄化植原体(onion yellows, OY)的tengu基因比对分析表明小麦蓝矮病植原体的tengu基因全长为213 bp(GenBank登录号:JF923816),编码70个氨基酸。序列同源性分析表明,小麦蓝矮病植原体tengu基因与翠菊黄化植原体(aster yellows, AY)和洋葱黄化植原体同源率分别为93.42%、95.77%。(2)Tengu基因编码蛋白的分子结构特征:利用ProtParam软件分析表明tengu蛋白大小为8.14 KDa,等电点为4.96。通过SignalP 3.0软件对信号肽切割位点分析表明,切割位点位于N端第32个丙氨酸和第33个天冬氨酸之间,除去信号肽的tengu成熟蛋白只有38个氨基酸,大小为4.42 KDa,等电点为3.98。利用ExPASy Proteomics Server软件进行亲疏水性分析结果为-0.270,为两性蛋白质,除去信号肽蛋白的结果为-1.308,为亲水性蛋白质。利用PSIPRED软件对该蛋白的二级结构预测结果表明该蛋白主要由3个α螺旋和1个β折叠股组成。利用PSIPRED软件对tengu蛋白的跨膜区进行预测分析,显示tengu蛋白有明显跨膜区,跨膜区在N端第11~30个氨基酸之间。说明tengu蛋白属于分泌蛋白,是植原体分泌到体外与寄主发生互作的蛋白。(3)构建了tengu基因的原核表达质粒pET30-tengu,为进一步在蛋白水平研究奠定了基础。(4)构建了pGR107-tengu、pGR107-imp、pGR107-hlyC重组质粒,转化农杆菌GV3101菌株,注射接种本氏烟。结果表明:对接种7 d的本氏烟的PCR和RT-PCR结果表明基因在本氏烟内复制与转录;除了空白对照,其它本氏烟都表现出了马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)病毒载体侵染的轻微花叶症状,说明菌株在本氏烟中繁殖,PVX载体侵染成功。在接种25 d后,与接种其它基因及空白对照的本氏烟相比,接种tengu基因的15株本氏烟中,有2株本氏烟表现分枝增多、植株变矮,说明小麦蓝矮病植原体的tengu基因在本氏烟中的表达能够引起本氏烟植株变矮、分枝增多,imp和hlyC基因与接种空载体的症状相同,未见其它明显症状。
摘要第6-8页
ABSTRACT第8-9页
第一章 文献综述第12-17页
    1.1 小麦蓝矮病的研究进展第12-14页
        1.1.1 危害与病害症状第12页
        1.1.2 病原与传播介体第12-13页
        1.1.3 发生规律与寄主范围第13页
        1.1.4 防治策略第13-14页
        1.1.5 分子生物学研究进展第14页
    1.2 植原体及其致病机理研究进展第14-16页
        1.2.1 植原体简介第14页
        1.2.2 植原体致病机理研究进展第14-15页
        1.2.3 Tengu 基因的研究进展第15页
        1.2.4 免疫膜蛋白的研究进展第15-16页
        1.2.5 植原体溶血素基因的研究进展第16页
    1.3 病毒载体在基因功能研究方面的进展第16页
    1.4 本研究的目的和意义第16-17页
第二章 小麦蓝矮病植原体tengu 基因的克隆及序列分析第17-28页
    2.1 材料第17-18页
        2.1.1 植物材料第17页
        2.1.2 菌株第17页
        2.1.3 仪器第17页
        2.1.4 试剂及溶液第17-18页
    2.2 方法第18-23页
        2.2.1 小麦总DNA 的提取第18页
        2.2.2 小麦蓝矮病tengu 基因的PCR 扩增第18-19页
        2.2.3 回收、连接及转化第19-20页
        2.2.4 序列测定和分析第20页
        2.2.5 原核表达载体的构建第20-23页
    2.3 结果与分析第23-26页
        2.3.1 PCR 扩增结果第23页
        2.3.2 测序结果及分析第23-26页
        2.3.3 原核表达载体的构建第26页
    2.4 讨论第26-28页
第三章 小麦蓝矮病植原体tengu 基因致病性测定第28-39页
    3.1 材料第28-29页
        3.1.1 植物材料第28页
        3.1.2 载体质粒和菌株第28页
        3.1.3 仪器第28页
        3.1.4 试剂及溶液第28-29页
    3.2 方法第29-32页
        3.2.1 重组病毒载体的构建第29-30页
        3.2.2 重组质粒转化农杆菌第30-31页
        3.2.3 农杆菌侵染本氏烟第31-32页
        3.2.4 PCR 检测第32页
        3.2.5 RT-PCR 检测第32页
    3.3 结果与分析第32-37页
        3.3.1 重组质粒检测结果第32-34页
        3.3.2 侵染本氏烟第34-35页
        3.3.3 DNA 检测结果第35-36页
        3.3.4 RNA 的RT-PCR 检测第36-37页
    3.4 讨论第37-39页
第四章 结论与研究设想第39-40页
    4.1 主要结论第39页
    4.2 进一步研究设想第39-40页
参考文献第40-44页
致谢第44-45页
作者简介第45页
硕士期间发表论文第45页
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