第一部分缝隙连接通讯对大脑中动脉缺血再灌注后海马损伤的影响一.缝隙连接阻断剂甘珀酸对MCAO后海马损伤的影响目的近年研究表明,大脑中动脉缺血后远隔区域海马可出现迟发性神经元死亡(delayedneuronal death, DND)现象。广泛存在于中枢神经系统中的缝隙连接(gap junction, GJ)是小分子物质快速扩散和交流传播的通道。本部分实验研究阻断缝隙连接通讯对大脑中动脉闭塞后海马迟发性神经元死亡的影响,并对其机制进行初步的探讨。方法将大鼠随机分为假手术组、MCAO组和MCAO+CBX组。假手术组和MCAO组不给予缝隙连接阻断剂甘珀酸(Carbenoxolone, CBX)干预,MCAO+CBX组于术前2小时预先侧脑室注射10μl CBX (5μg/μl)。颈内动脉插线法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,术后24h进行神经行为学评分; MCAO后3d采用尼氏染色和TUNEL技术检测海马神经元结构变化、DND发生率及凋亡细胞百分率；在MCAO后30d,再将各组大鼠进行水迷宫测试,以观察各组大鼠的学习记忆功能情况。结果假手术组的大鼠在MCAO术后24h,无神经功能缺失,海马区均未见神经元凋亡,术后30d水迷宫测试,提示学习记忆功能正常。MCAO组动物未给予CBX干预,术后24h神经功能缺失明显,术后3天有50%大鼠海马区可见神经元凋亡；缺血30d后水迷宫测试,提示学习记忆功能受损明显。MCAO+CBX组缺血后24h神经功能缺失较MCAO组有所减轻,术后3d后出现海马区DND(+)比例明显低于MCAO组,凋亡细胞百分率也低于MCAO组；术后30d水迷宫测试,提示学习记忆功能受损,但程度较MCAO组轻(p<0.05)结论缝隙连接通讯被阻断以后,MCAO后大鼠海马迟发性神经元死亡的发生率及DND(+)细胞百分率明显降低,缺血后远期的学习记忆功能也明显改善。由此可以推断缝隙连接通讯在局灶性脑缺血后远隔的海马区域的迟发性损伤的形成中可能起到了一定的作用。二.Connexin43基因敲除小鼠MCAO后海马损伤的研究目的本研究观察减少胶质细胞缝隙连接通讯对MCAO后海马迟发性神经元死亡的影响,并对其机制进行了初步的探讨。方法根据基因型鉴定结果,实验小鼠分为CX43+/+假手术组、CX43+/-假手术组、CX43+/+MCAO组和CX43+/-MCAO组。建立MCAO模型,于MCAO术后1d,比较各组小鼠之间的神经功能评分；术后3d,采用尼氏染色和TUNEL技术检测海马神经元结构变化、DND发生率及丢失及凋亡细胞百分率；MCAO后30d,进行水迷宫测试,观察各组小鼠的学习记忆功能情况。结果假手术组小鼠术后24h神经行为学评分为0,无神经功能缺失；缺血后3d改组小鼠海马区均未见神经元凋亡；缺血.30d后水迷宫测试结果提示学习记忆功能正常。CX43+/+MCAO组缺血后24h神经功能评分为2.36±0.21,术后3d有部分小鼠海马区可见神经元凋亡：缺血30d后水迷宫测试结果提示学习记忆功能受损明显。CX43+/-MCAO组小鼠缺血后24h神经功能评分为1.72±0.17；术后3天海马DND阳性率明显低于CX43+/+MCAO组,凋亡细胞百分率也明显低于CX43+/+MCAO组；缺血30d后水迷宫测试,提示学习记忆功能受损,但程度较CX43+/+MCAO组轻(p<0.05)。结论减少胶质细胞间缝隙连接通讯,减轻了MCAO后小鼠的神经功能缺失症状,降低了海马DND的发生率及DND(+)细胞百分率,改善缺血后远期的学习记忆功能。可以推断胶质细胞缝隙连接通讯在局灶性脑缺血后远隔的海马区域的迟发性损伤的形成中起到了一定的作用。第二部分缝隙连接介导的扩散性抑制对大脑中动脉缺血再灌注后海马损伤的影响一.MCAO诱导大鼠皮层和海马SD波的在体电生理学记录目的扩散性抑制(spreading depression, SD)是一种在中枢神经系统发现的有特征性的离子、代谢和血液动力学变化的病理生理现象,在偏头痛,脑血管病,颅脑外伤以及一过性全面性遗忘等临床疾病中扮演重要角色。在本部分研究中,我们对扩散性抑制的在体电生理学记录技术平台的建立方法及其在局灶性脑缺血后皮质电生理学研究中的应用进行了初步讨论。方法本部分研究用右侧大脑中动脉栓塞脑缺血模型诱导SD；用Ag/AgCl电极记录细胞外直流电位变化,并探讨了在体记录SD的电生理学方法。随后将记录电极加以改良应用于局灶性脑缺血后皮层和海马CA1区的电生理学研究。结果MCAO脑缺血模型诱导组,在阻断大脑中动脉之前未记录到SD波,在MCAO术后的60分钟内,在皮质记录到重复规律SD发作。但仅有部分实验动物在MCAO后的60分钟内,可以记录到海马CA1区重复规律的SD波。结论本部分研究建立了SD的在体电生理学记录技术平台,改良记录电极,应用于局灶性脑缺血后皮质缺血区的电生理学观察,在MCAO模型记录到了皮层和海马SD波。二.扩散性抑制对MCAO后海马损伤的影响目的局灶性大脑中动脉缺血后远隔缺血脑区的海马出现迟发性神经元死亡而这一远隔损伤现象的机理目前尚不明确。扩散性抑制(SD)是与多种临床常见的中枢神经系统疾病密切相关的病理生理现象。我们推测DND和SD之间存在一定的关系,本部分旨在研究大鼠局灶性脑缺血诱导的SD对同侧海马DND的影响。方法将大鼠随机分成三组：假手术组、MCAO组和MCAO+MK-801组。MCAO+MK-801组在制作右侧MCAO模型30 min前腹腔注射MK-801(2mg/kg体重),以阻断缺血诱导的SD。颈内动脉插线法制备大鼠MCAO模型,TTC染色判断模型是否成功；利用第一部分研究所建立的技术平台采用电生理学方法记录SD波,尼氏染色和TUNEL染色检测海马DND；观察阻断MCAO诱导的SD对海马迟发性神经元死亡的影响。结果不给予MK-801的情况下,大脑中动脉缺血模型有39%的动物于再灌注3d出现海马CAl区尼氏染色阳性神经元数目明显减少,大量神经元脱失,以及CAl区锥体神经元普遍TUNEL染色阳性；用MK-801阻断SD后仅10%的动物于再灌注3d出现海马CAl区大量神经元脱失,而CAl区锥体神经元普遍TUNEL染色阳性。假手术组所有动物均未出现海马神经元染色脱失以及TUNEL染色阳性细胞。阻断SD使MCAO后海马出现DND的机率明显减小(p<0.05)。结论阻断SD使MCAO后海马出现DND的机率明显减小,局灶性脑缺血引起的海马DND可能与SD由缺血区不断向远隔部位播散有关。三.侧脑室注射甘珀酸对MCAO诱导的扩散性抑制的影响目的扩散性抑制在中枢神经系统疾病中有着重要的作用。其发生机制可能与缝隙连接有关。本部分旨在探讨缝隙连接阻断剂CBX对大鼠MCAO诱导的皮层和海马SD的影响,进而研究缝隙连接与SD的关系以及二者在局灶性脑缺血损伤中的作用。方法将大鼠随机分为假手术组、MCAO组、MCAO+CBX组。用局灶性脑缺血(MCAO模型)诱导SD波。假手术组和MCAO组均不给予CBX干预,MCAO+CBX组于术前2h预先侧脑室注射10μl CBX(5μg/μl)。用MS-4000U生物信号采集分析系统对波幅、时程进行计算分析。结果假手术组动物均未记录到SD波；与MCAO组相比较,MCAO+CBX组所记录到SD波波幅明显减小(p<0.05),SD波的阳性率降低(p<0.05),但是SD波的时程没有明显差异(p>0.05)。结论缝隙连接阻断剂CBX对MCAO诱导的皮层和海马SD波都有着明显的抑制作用,可以推测缝隙连接在SD的发生发展过程中具有重要的作用。
