骨质疏松症是一种以骨量低下和骨结构破坏为特征的疾病,可导致骨强度降低,骨折危险性增加。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)属于TNF受体家族成员,主要由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和成骨细胞(osteoblasts, OB)分泌,能抑制破骨细胞(osteoclasts, OC)生成、活化,减少骨吸收,增加骨密度。骨髓间充质干细胞和成骨细胞均可表达雌激素受体α和β,故雌激素可能对骨髓基质细胞和成骨细胞的分化和功能有直接作用。骨髓间充质干细胞来源于骨髓基质的一种间充质细胞,它具有多种分化潜能,可向成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等方向分化。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程需要诱导成骨细胞条件培养基。雌激素、OPG和BMSCs三者之间的紧密联系及相互作用,为探讨蛋鸡髓质骨形成、骨质疏松的发病机理及其防治提供理论依据。试验Ⅰ鸡胚BMSCs的成骨细胞诱导培养与鉴定目的：探讨18日龄鸡胚骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养生长规律以及定向诱导分化为成骨细胞的条件和诱导的成骨细胞的功能。方法：冲洗胫骨骨髓,以全骨髓贴壁法进行体外贴壁培养、传代。取第三代细胞诱导培养,同时设空白对照。倒置显微镜下观察其形态,通过MTT法测定细胞增殖率,经Annexin V-FITC和PI染色后,用流式细胞仪检测细胞周期情况。用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)底物显色试剂检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP), Van-Gieson染色检测Ⅰ型胶原,茜素红染色检测钙结节。结果：全骨髓贴壁培养法可获得BMSCs, BMSCs和诱导的成骨细胞具有活跃的增殖能力。诱导培养后,ALP检测、Ⅰ型胶原染色与钙化结节染色均为强阳性。结论：鸡胚BMSCs易于体外分离培养、扩增,并可定向诱导为典型的成骨细胞。试验Ⅱ17β-E2对鸡胚BMSCs诱导的成骨细胞ALP活性、OPG、BGP与ColⅠmRNA表达的影响目的：观察17β-雌二醇(17β-E2)对鸡胚骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)诱导的成骨细胞的作用,为探索髓质骨形成及其蛋鸡骨质疏松症发病机理提供理论基础。方法：体外分离培养鸡胚骨髓间充质干细胞,利用贴壁法纯化细胞。取第三代细胞进行成骨细胞诱导,将诱导的成骨细胞分为5个试验组,分别添加含有10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mo·l·L-1浓度17β-E2的成骨细胞诱导培养基,同时设空白对照组。用MTT法测定不同浓度17β-E2下的生长曲线,利用PNPP法测定碱性磷酸酶活性,选择其最有效浓度。并使用该有效浓度作用于诱导培养的成骨细胞,通过流式细胞术观察该浓度17β-E2对成骨细胞凋亡的影响；使用RT-PCR技术观察17β-E2对诱导的成骨细胞OPG、骨钙素(bone r-carboxyglutamic protein, BGP)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ, ColⅠ)的mRNA影响。结果：与对照组比较,17β-E2能够促进诱导的成骨细胞增殖,ALP分泌,抑制成骨细胞凋亡,浓度为10-9 mol·L-1的17β-E2促进OPG、BGP与ColⅠmRNA表达,差异显著(P<0.05)。结论：10-9mol·L-1的17β-E2可增强鸡胚BMSCs诱导的成骨细胞功能。试验ⅢchOPG对鸡胚BMSCs诱导的成骨细胞ALP活性及BGP与ColⅠmRNA表达的影响目的：研究外源性鸡骨保护素蛋白(chicken osteoprotegerin, chOPG)对鸡胚BMSCs诱导的成骨细胞增殖、ALP活性、细胞凋亡及BGP与Col I mRNA的表达作用,探讨其在蛋鸡髓质骨形成过程中的调节作用及其蛋鸡骨质疏松症发病机理提供理论基础。方法：冲洗胫骨骨髓,以全骨髓贴壁法进行体外培养,贴壁传代。将第三代细胞诱导成成骨细胞培养。同时将诱导的成骨细胞分为3个试验组,同时设立空白对照,分别添加含有终浓度为4.0 mg·mL-1,0.4mg·mL-1,0.04mg·mL-13种浓度的chOPG的成骨细胞诱导分化液,用MTT法测定成骨细胞的增殖,利用PNPP法测定ALP,筛选出chOPG最有效浓度培养BMSCs诱导的成骨细胞,通过流式细胞术观察其对成骨细胞凋亡的影响。使用RT-PCR技术观察外源性chOPG对BMSCs诱导的成骨中BGP、ColⅠ的mRNA表达的影响。结果：获得的骨髓间充质干细胞细胞其生化指标稳定,骨髓间充质干细胞成骨细胞分化后,ALP分泌明显增加,可产生大量的矿化结节,具有成熟成骨细胞的表型特征。加入外源性chOPG后,与对照组相比,试验组成骨细胞的增殖、ALP分泌均显著下降、细胞的凋亡增加。RT-PCR检测显示,与对照组相比,诱导培养基中chOPG为0.4 mg·mL-1时,诱导培养的成骨细胞BGP和ColⅠmRNA的表达显著下降(P<0.05)。结论：外源性chOPG对体外鸡胚BMSCs诱导培养成骨细胞增殖、ALP分泌有抑制作用,对BGP、Coll的mRNA的表达起到下调作用。
