通络方剂对糖尿病大鼠肾脏ERK1/2信号转导通路的影响及对肾脏保护机制的研究

糖尿病肾病论文 细胞外信号调节蛋白论文 血管紧张素Ⅱ论文 结缔组织生长因子论文 糖基化终末产物受体论
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目的:糖尿病(diabetes mellitus, DM)可以引起视网膜、肾脏、神经等多种器官并发症,其中糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最为严重的慢性并发症之一,其发病率逐年上升。DN早期主要的病理特点是肾小球基底膜增厚、肾小球系膜细胞增殖、’肾小球系膜的膨胀所致的肾肥大,临床表现为高滤过和微量蛋白尿。随着病程进展肾小球系膜基质增加,促进肾小球硬化和肾小管间质纤维化,肾脏功能逐渐下降,最终导致终末期肾功能衰竭。目前,体内外实验表明细胞外信号调节蛋白(extracellular signal regulated kinase, ERK)信号转导通路在糖尿病肾脏疾病的发生、发展过程中起着重要的作用。ERK可被多种生长因子和细胞因子激活,介导细胞生长、增殖、分化。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可以刺激血管平滑肌细胞和肾脏系膜细胞、肾小管上皮细胞肥大。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是具有促进内皮细胞增殖和迁徙,增加血管通透性的细胞因子。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是促进纤维化的细胞因子。糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)与糖基化终末产物受体(advanced glycation end products receptor, RAGE)结合后可促进多种细胞因子的释放,引起血管内皮损伤、细胞外基质增生等病理改变。AngⅡ、VEGF、CTGF、AGEs与ERK信号转导通路关系密切。体外实验已证实,AngⅡ、VEGF、AGEs可以激活肾脏细胞ERK通路,促进CTGF的表达。通络方剂主要成分是人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、赤芍等药物。已有实验发现通络方剂具有改善肾小球基底膜和高糖引起的氧化损伤,增加机体抗氧化能力的作用,能够减少肾组织中AngⅡ、AGEs产生,但通络方剂能否影响细胞内信号转导通路目前尚不明确。本实验拟研究通络方剂对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏AngⅡ、VEGF、CTGF、RAGE、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达的影响,以及通络方剂对肾脏保护作用的可能机制。方法:SPF级成年雄性SD大鼠,体重200g±20g,随机分组:建模组给予单次腹腔注射STZ60mg/kg,72小时后尾静脉取血测随机血糖,以血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型,正常组(A组)10只。糖尿病成模大鼠按随机分为5组:糖尿病非治疗组(B组)10只、低剂量通络方剂组(C组,0.5g/(kg·d))10只、中剂量通络方剂组(D组,1.0g/(kg·d))10只、高剂量通络方剂组(E组,2.0g/(kg·d))10只、氯沙坦组(F组,30mg/(kg·d))10只。糖尿病大鼠造模成功后适应性饲养1周后,按分组分别给予不同处理因素,A组和B组给予等体积生理盐水灌胃,每日定时灌胃,持续给药12周后处死,称量体重,取血检测血糖(GLU)、血脂(TG、CHOL、HDLC、LDLC)、血肌酐(BCREA)、尿素氮(BUN),留24小时尿检测尿肌酐(CREA)、尿蛋白(UPRO24)、尿微量白蛋白(UMA),取左肾称重(KW),计算肾重/体重比(KW/BW),在透射电镜以及HE、PAS染色后在光镜下观察肾脏病理改变,Elisa法检测血清及肾脏组织中AngⅡ的含量,免疫组织化学法检测p-ERK1/2蛋白的表达,Western blot法检测VEGF、RAGE、CTGF、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达,SYBR Green real-time PCR方法检测肾组织中的CTGF mRNA、RAGE mRNA的表达。结果:1、造模后的各组大鼠的体重与正常组大鼠比较均明显减轻(P<0.05),C、D、E、F治疗组体重较非治疗组增加,其中D组大鼠体重较B组明显提高(P<0.05)。糖尿病造模各组肾脏肥大指数较正常对照组明显增高(P<0.05),各糖尿病治疗组肾脏肥大指数较糖尿病非治疗组下降,其中D、E、F组较非治疗组明显下降(P<0.05)。2、糖尿病成模各组大鼠的GLU、TG均较正常组明显升高(P<0.05)。各糖尿病大鼠成模组HDLC、LDLC均较正常组明显降低(P<0.05)。各糖尿病治疗组大鼠与糖尿病非治疗组间GLU、TG, HDLC、LDLC均无统计学差异(P>0.05)。各组大鼠CHOL无统计学意义。3、糖尿病成模大鼠BUN、Ccr、UPRO24、UMA均较正常组明显升高(P<0.05),糖尿病各治疗组BUN、Ccr, UMA均较非治疗组明显降低(P<0.05), D、E、F治疗组24小时尿蛋白较非治疗组明显下降(P<0.05),C组UPRO24较非治疗组减少但无统计学差异。4、普通光镜下观察A组未见病理改变,B组肾小球基底膜增厚,系膜细胞增生,肾小管浊肿变性,肾间质轻度纤维化。糖尿病各治疗组较B组有不同程度改善。透射电镜观察可见B组基底膜增厚,足突融合,肾小球内皮细胞断裂,肾小管上皮细胞空泡变性、坏死,C、D、E、F组较B组病变轻。5、B、C、E、F组血清AngⅡ含量较A组明显升高(P<0.05),D组较A组升高,但无统计学差异。各治疗组均较非处理组血清AngⅡ含量明显降低(P<0.05)。C、E组血清AngⅡ含量较F组升高有统计学差异(P<0.05),D组血清AngⅡ含量与A、F组无统计学差异。各糖尿病成模组大鼠肾脏组织中AngⅡ含量较正常组明显升高(P<0.05),糖尿病各处理组肾脏AngⅡ含量均较糖尿病未处理组明显下降(P<0.05),D、E组肾脏AngⅡ含量与F组没有统计学差异(P>0.05)。6、B、C、D、E、F组中VEGF、RAGE、CTGF、p-ERKl/2蛋白均较A组明显增加(P<0.05),C、D、E、F组VEGF、RAGE、CTGF、p-ERK1/2蛋白表达较B组减少(P<0.05),各组Total-ERK1/2蛋白表达组间差异没有统计学意义(P>0.05)。7、D、E、F组大鼠肾脏组织中RAGE mRNA的水平较B组明显下降(P<0.05)。D、E组大鼠肾脏组织中CTGF mRNA的水平较B组、F组明显降低(P<0.05)。与B组相比,C组大鼠肾脏RAGE mRNA、CTGF mRNA的水平降低,但无统计学差异(P>0.05)。结论:1、糖尿病大鼠肾脏病理结构及肾功能受损。2、通络方剂可以减轻糖尿病大鼠肾脏病理改变,改善肾功能,通络方剂保护肾脏的作用与氯沙坦相似。2、通络方剂对肾脏的保护机制可能与抑制AngⅡ、VEGF、RAGE表达,阻断ERK1/2信号转导通路,降低CTGF的表达延缓肾脏纤维化进程有关。
摘要第5-8页
Abstract第8-11页
缩略词表第12-14页
前言第14-17页
第一部分 通络方剂对糖尿病大鼠代谢及肾脏形态结构的影响第17-37页
    一、材料与方法第17-23页
    二、实验结果第23-35页
    三、讨论第35-37页
第二部分 通络方剂对糖尿病大鼠肾脏Ang Ⅱ、RAGE、VEGF、CTGF表达的影响第37-55页
    一、材料与方法第37-47页
    二、结果第47-52页
    三、讨论第52-55页
第三部分 通络方剂对糖尿病大鼠肾脏ERK1/2信号转导通路的影响第55-62页
    一、材料与方法第55-58页
    二、结果第58-60页
    三、讨论第60-62页
参考文献第62-66页
ERK1/2信号通路在糖尿病肾病发生、发展中的作用第66-73页
致谢第73页
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