乳腺癌是一种雌激素依赖性肿瘤。雌激素通过与雌激素受体结合,激活特异的下游信号通路表达,刺激乳腺癌细胞的增殖,介导了乳腺癌的发生和发展。抗雌激素治疗作为乳腺癌重要的辅助治疗手段,可以明显改善患者预后。然而并不是所有乳腺癌都能采用抗雌激素治疗。对抗雌激素治疗药物的先天性耐药和获得性耐药,都可引起抗雌激素抵抗,导致治疗的失败。因此,明确抗雌激素治疗抵抗的分子机制,将极大的促进乳腺癌抗雌激素治疗的发展,提高乳腺癌患者的治疗效果,改善预后。目前已知雌激素受体ER-α表达下调或功能异常,是抗雌激素治疗耐药的主要原因。而ER-α转录表达的异常与表观遗传调节密切相关。但是ER-α表达下调的具体机制尚不完全清楚。本研究中,我们发现转录因子ZEB1可以通过招募甲基转移酶DNMT3B和去乙酰化酶HDAC1到ER-α基因启动子,促进其发生高甲基化,从而诱导乳腺癌细胞中ER-α表达下调,导致抗雌激素治疗耐药。首先,我们通过在线数据库预测分析发现,在ER-α基因启动子区存在一个大小为267 bp的Cp G岛。利用DNMT3B和HDAC1抗体行染色质免疫共沉淀实验Ch IP证明这个Cp G岛是一个潜在的差异性甲基化调控区DMR。而在我们的前期研究中发现,ZEB1与乳腺癌组织中ER-α的表达呈负相关。并且我们同样通过数据库分析发现这个Cp G岛内包含有两个ZEB1的潜在转录结合元件E2box序列。于是,我们检测了乳腺癌细胞系MDA-MB-231/SUM-159和MCF-7/ZR75-1中ER-α基因启动子甲基化程度,并且通过过表达及沉默ZEB1,从功能上证明了ZEB1对ER-α基因启动子的甲基化调控作用。接下来,我们通过体外实验中使用抗雌激素治疗的代表性药物他莫西芬(tamoxifen)和氟维司群(fulvestrant)处理乳腺癌细胞,证明了ZEB1过表达可以下调乳腺癌细胞ER-α的表达,并且降低乳腺癌细胞对抗雌激素药物的敏感性;相反地,沉默ZEB1的表达可以部分恢复ER-α的表达,并且提高乳腺癌细胞对抗雌激素药物的敏感性。机制研究证明,ZEB1可以同时与甲基转移酶DNMT3B和去乙酰化酶HDAC1在ER-α启动子上形成蛋白复合物,进而诱导DNA发生高甲基化,抑制ER-α的转录,沉默其表达。更重要的是,通过RNA干扰敲低ZEB1表达后可引起ER-α启动子的去甲基化,进而部分恢复ER-α的表达,增加乳腺癌对抗雌激素治疗的敏感性。最后,经过对乳腺癌临床标本的分析,我们发现ZEB1和ER-α的蛋白表达评分呈负相关。在乳腺癌ER-α阴性病例中,ZEB1高表达,并且与ER-α启动子高甲基化呈正相关,而在ER-α阳性性病例中,结果与之相反。在小鼠移植瘤模型中,我们进一步证明了下调ZEB1可以部分恢复ER-α的表达,并提高乳腺癌对抗雌激素治疗的敏感性。综上所述,我们的研究证明了ZEB1是介导乳腺癌抗雌激素耐药的关键因子。ZEB1及其下游信号通路可能作为乳腺癌治疗的新靶点。靶向ZEB1,并联合应用特异的表观调控抑制剂,有望成为克服乳腺癌抗雌激素治疗耐药的新策略。侵袭和转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因,而肿瘤血管生成是其侵袭和转移的重要因素。在肿瘤血管生成过程中,血管内皮生长因子VEGF信号通路发挥了关键的调控作用。靶向血管内皮生长因子受体VEGFR2的小分子抑制剂,作为有效的抗血管新生药物,已经广泛应用于恶性肿瘤的临床治疗。其中代表性药物为治疗晚期肾癌的小分子药物索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)。虽然临床前研究和初期的临床实验得到了理想结果,但是随着临床的逐渐应用,发现大多数这类药物都存在一些未知的副作用,并且其疗效也需要进一步验证。因此,开发新型而低毒的VEGFR2小分子抑制剂仍然是当前研究的热点。我们在本课题中,首先以sorafenib为药物主体结构,采用计算机辅助设计,生物化学合成的方法,得到25个新型的靶向VEGFR2的小分子抑制剂。接着,以sorafenib为阳性对照,利用转基因斑马鱼(Fli-1:EGFP)模型,对这些化合物的抗血管生成作用进行筛选,得到了一种高效且低毒的VEGFR2小分子抑制剂YLL545。接下来,我们同样以sorafenib为阳性对照,用不同浓度的YLL545处理人脐静脉血管内皮细胞HUVECs。通过CCK8细胞活力实验检测发现YLL545抑制HUVECs细胞增殖的IC50为5.844μM。而进一步用Ed U细胞增殖实验检测发现,YLL545抑制HUVECs的增殖是通过减少细胞S期DNA合成导致的。此外,划痕实验和transwell实验提示YLL545可以抑制HUVECs细胞的迁移和侵袭。重要的是,成管实验和Matrigel胶塞实验证明,与sorafenib相比,YLL545能够更有效地抑制HUVECs细胞的成管能力及其在小鼠体内的血管生成作用。进而,我们需要明确YLL545抑制血管生成的分子机制。通过WB检测发现,YLL545可以明显抑制由VEGF诱导的VEGFR2磷酸化,及其下游信号调节因子的蛋白磷酸化水平,包括细胞外调节蛋白激酶ERK、信号转导子与转录激活子STAT3和雷帕霉素靶蛋白m TOR。此外,利用RT2 Profiler PCR Array,我们还发现,YLL545可以通过VEGFR2非依赖途径抑制其他血管生成相关基因的表达来影响血管生成,其中包括:FN1、TEK、ENG、THBS1和ITGAV。由于乳腺癌细胞同样表达VEGFR2、m TOR、STAT3和ERK,提示YLL545具有潜在的靶向肿瘤细胞的作用。为此,我们选择了乳腺癌细胞MDA-MB-231进行研究。通过CCK8、Ed U和平板克隆形成实验均证明了2.5μM YLL545就能明显抑制肿瘤细胞增殖,并且Annexin V和PI染色证明了YLL545还能促进MDA-MB-231细胞的凋亡。而YLL545抑制正常乳腺上皮细胞和肝上皮细胞增殖的IC50分别是35.83和33.40μM,表明YLL545对正常组织细胞的毒性甚小,其特异性抑瘤作用与细胞毒无关。最后,我们在小鼠移植瘤模型中验证了YLL545抑制血管生成的体内作用。结果显示,口服YLL545 50 mg/kg/d即可抑制乳腺癌移植瘤的血管生成,进而抑制肿瘤生长,抑制率达50%。并且与对照组相比,YLL545实验组小鼠并未出现药物毒副反应。综上所述,作为一种新型、安全、高效的血管生成小分子抑制剂,YLL545有望将来应用于肿瘤,特别是乳腺癌的治疗。
