常用吸入麻醉剂七氟烷可诱导脑缺血耐受,但机制不清,有待深入研究。Notch信号是一种进化保守的信号通路,介导相邻细胞间信号交换,影响神经发育过程中的细胞分化、增殖与凋亡等多种程序。近年来的研究亦证实Notch信号通过影响细胞凋亡参与脑缺血再灌注损伤。这提示Notch信号通路有可能也是调控七氟烷预处理脑保护作用的重要信号通路。如能明确这一问题,将有望为脑缺血防治提供新的干预靶点。因此,本课题以局灶性脑缺血模型为对象,应用Notch转录因子RBP-J基因敲除小鼠,研究经典Notch通路在常用吸入麻醉剂七氟烷预处理诱导脑保护效应中的作用及机制,并对Notch与另一重要信号通路JAK-STAT在脑缺血损伤中的相互作用关系做以阐释,以期为七氟烷预处理脑保护机制提供新的思路,为脑保护的临床应用提供理论基础和干预靶点。目的1.研究脑缺血再灌注对Notch信号通路表达的影响2.研究Notch信号通路在脑缺血再灌注中的作用方法1.小鼠局灶性脑缺血再灌注后Notch信号表达变化雄性C57BL/6小鼠随机分为2组：假手术组(Sham, n=5)和缺血再灌注组(MCAO), MCAO组进行1h缺血,于再灌注后2h、24h、72h取半暗带组织(每组n=5),Western blot方法检测NICD蛋白含量,Real-time PCR方法检测Hes1和Hes5靶基因mRNA水平。2. Notch信号抑制剂对小鼠局灶性脑缺血损伤的影响雄性C57BL/6小鼠36只随机分为3组(每组n=12)：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(MCAO)和DAPT组。MCAO组仅给予1h大脑中动脉阻闭,DAPT组于MCAO模型制作前2h给予Notch通路抑制剂DAPT, 100mg/kg,i.p.。3组均于再灌注后2h、24h、72h分别按照Garcia和Longa两种方法进行神经行为学评分,再灌注后72h计算梗死容积。3.RBP-J基因敲除对脑缺血再灌注损伤的影响雄性野生型C57BL/6小鼠(Wild type, WT)、雄性RBP-J基因敲除小鼠(RBP-J-/-)和与其同窝出生、性别相同、发育一致的杂合子小鼠(RBP-J+/-)共3组(每组n=12)。所有动物均给予MCAO1h,于再灌注后2h、24h、72h分别按照Garcia和Longa两种方法进行神经行为学评分；再灌注后24h每组随机取5只小鼠进行灌注,取脑组织冰冻切片进行Caspase-3染色和TUNEL染色,其余小鼠于再灌注后72h进行TTC染色计算梗死容积。结果1.脑缺血再灌注增加半暗带NICD蛋白含量Western blot显示缺血再灌注后2h,缺血半暗带NICD含量是Sham组的1.74±0.31倍；缺血再灌注后24h,NICD含量进一步增加,是Sham的2.62±0.32倍,并明显高于MCAO后2h组(P<0.05)；缺血再灌注后72h NICD含量增加到Sham组的3.28±0.19倍,仍高于24h组(P<0.05)。2.脑缺血再灌注增加半暗带Hes1和Hes5基因转录Real-time PCR结果显示,Hes1mRNA于再灌注后24h较Sham组显著增加(P<0.05 vs. Sham), MCAO后72h Hes1 mRNA水平亦明显高于24h组(P<0.05)。Hes5 mRNA于再灌注后24h显著上升(P<0.05 vs.Sham),再灌注72h仍显著高于Sham组(P<0.05),但与24h比无统计学差异。3. DAPT减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤缺血前给予DAPT,小鼠脑缺后24、48、72h神经行为学Garica评分均明显高于MCAO组(P<0.05),而Longa方法评估的神经功能损伤评分在再灌注后72h显著低于MCAO组(P<0.05)。DAPT组动物的脑梗死容积显著小于MCAO组(P<0.05)。4.构建RBP-J基因敲除小鼠含有CamKII-Cre和RBP-J双转基因小鼠相互交配后子代产出中,RBP-J基因敲除纯合子与杂合子小鼠的比例符合孟德尔遗传定律。纯合子及杂合子小鼠均发育正常,无体重、活力等异常。小鼠剪尾提取基因组,经PCR方法鉴定基因型。免疫组化结果显示,RBP-J敲除纯合子与野生型小鼠相比,海马和皮层NICD阳性神经元明显减少；Hes1和Hes5蛋白在RBP-J敲除纯合子小鼠脑组织切片中表达微弱。5.RBP-J基因敲除减轻脑缺血再灌注损伤缺血再灌注后24h、48h、72h, RBP-J-/-组神经行为学Garica评分明显高于MCAO组和RBP-J+/-组(P<0.05), MCAO组和RBP-J+/-组之间无统计学差异。RBP-J-/-组神经功能损伤Longa评分在再灌注后72h较其他两组显著下降(P<0.05),其他两组之间亦无统计学差异。RBP-J-/-组脑梗死容积百分比较WT和RBP-J+/-显著下降(P<0.05),WT和RBP-J+/-之间无显著性差异。TUNEL及Caspase-3染色显示,WT组TUNEL和Caspase-3阳性细胞明显多于RBP-J-/-组,RBP-J+/-小鼠MCAO后凋亡细胞亦多于RBP-J-/-组,但WT和RBP-J+/-两组之间没有统计学差别。第二部分脑缺血再灌损伤中Notch调控JAK-STAT信号活化机制目的1.研究脑缺血再灌注对于Notch信号及STAT3分子的活化是否一致2.探讨脑缺血损伤后STAT3活化是否受到Notch信号调控方法1.脑缺血再灌注后Notch与JAK-STAT通路活化的相关性野生型雄性C57BL/6小鼠20只,分空白对照组(Naive)和缺血再灌注组(MCAO)。Naive组(n=5)不给予任何处理,取缺血半暗带相似区脑组织。在再灌注后2h、24h、72h(n=5)分别取MCAO组缺血半暗带脑组织。冰上提取脑组织蛋白质,并进行定量,采用Western blot分别检测NICD.Hes1、Hes5、STAT3、pSTAT3蛋白水平。证实脑缺血再灌注后Notch-Hes经典活化级联通路与STAT3是否同时被激活。2.脑缺血后Notch信号激活对STAT3活化的影响雄性RBP-J基因敲除小鼠(RBP-J-/-)16只,分为空白对照组(Naive)和缺血再灌注组(MCAO)。Naive组(n=4)不给予任何处理,在缺血半暗带的相似区取脑组织。MCAO组小鼠于再灌注后2h、24h、72h取缺血半暗带脑组织(n=4),提取蛋白质并进行蛋白定量。Western blot检测Hes1、Hes5、STAT3、pSTAT3蛋白水平。证实STAT3活化是否受Notch信号通路调控。3.Hes蛋白调控STAT3磷酸化野生型雄性C57BL/6小鼠30只,分为6个组：Hes1-SiRNA、Hes5-SiRNA、Vehicle、Hes1-SiRNA+MCAO、Hes5-SiRNA+MCAO、Vehicle+MCAO。再灌注后24h取脑组织,采用Western blot方法检测,Hes1、Hes5、STAT3和pSTAT3的蛋白含量变化。证实STAT3磷酸化是否由Hes蛋白调控激活。结果1.脑缺血再灌注激活Notch信号和STAT3分子野生型小鼠MCAO后2h、24h、72h NICD蛋白含量逐渐增高。Notch靶基因Hes1、Hes5蛋白含量于再灌注后24h和72h均明显高于Naive组及再灌注2h组,但Hes1或Hes5蛋白在再灌注后24h与72h两组间均无显著性差异。缺血再灌注后脑组织内STAT3蛋白含量与Naive组相比无统计学差异,而pSTAT3/STAT3水平在再灌注后2h显著升高,在2h、24h、72h三组间无统计学差异。2.脑缺血再灌注后STAT3分子激活受Notch信号调控RBP-J-/-小鼠再灌注后2h, NICD蛋白含量较Naive组显著增加,2h、24h、72h三组之间无显著性差异,Hes1、Hes5、STAT3、pSTAT3/STAT3含量则无明显改变。结果证实敲除Notch信号转录因子RBP-J,脑缺血再灌注后STAT3分子磷酸化受到抑制。3. Hes1-SiRNA和Hes5-SiRNA分别抑制Hes1和Hes5蛋白表达SiRNA脑室注射后24h,野生型小鼠脑组织Hesl蛋白表达较基础值降低,48h至72h仍维持在较低水平。Hes5-SiRNA注射后24h能够显著抑制小鼠脑组织Hes5蛋白的表达,注射后48h至72h仍具有抑制效应。4.STAT3分子磷酸化受Hesl蛋白调控脑缺血再灌注后24h, Hes1-SiRNA组Hesl蛋白含量明显低于Vehicle组,SiRNA+MCAO组Hesl蛋白的含量亦明显低于Vehicle+MCAO组,证实Hes1-SiRNA (?)(?)抑制生理水平及MCAO后Hesl蛋白表达；STAT3蛋白含量在四组中无显著性变化；pSTAT3在Hes1-SiRNA和Vehicle组无表达,在SiRNA+MCAO组仅有轻微条带,Vehicle+MCAO组pSTAT3表达水平较其他三组显著增加。脑缺血再灌注后24h,与、Vehicle组相比,Hes5-SiRNA组Hes5蛋白含量明显降低,Hes5-SiRNA+MCAO组Hes5蛋白的含量亦低于Vehicle+MCAO; STAT3蛋白含量在四组中保持稳定；SiRNA+MCAO组和Vehicle+MCAO组的pSTAT3水平均明显高于SiRNA和Vehicle组,两组间无差异。第三部分Notch信号通路参与七氟烷预处理脑保护作用及机制目的1.研究七氟烷预处理诱导小鼠脑缺血耐受效应2.研究七氟烷预处理对于脑组织中Notch信号表达的影响3.研究Notch信号通路在七氟烷预处理脑保护中的作用方法1.七氟烷预处理的脑耐受效应研究将30只C57BL/6小鼠随机分为3组(n=10)：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(MCAO)、七氟烷预处理组(Sevo+MCAO)。Sevo+MCAO组小鼠接受2.5%七氟烷与100%氧气混合气体的预处理,1h/d,连续5d,末次预处理后24小时行MCAO。所有动物与再灌注后24h、48h、72h进行神经行为学评分(Garcia),末次评分后断头取脑,进行TTC染色计算脑梗死容积百分比。2.七氟烷预处理对Notch信号通路表达的影响10只雄性C57BL/6小鼠随机分为2组(n=5)：假处理组(Sham)和预处理组(Sevo),预处理接受2.5%七氟烷,lh/d,连续5天的预处理,Sham组接受同时程的氧气处理。所有动物于末次预处理后0h、2h、24h取脑组织；将所取脑组织用Western blot方法检测NICD蛋白含量,Real-time PCR方法检测Hes1和Hes5靶基因mRNA水平。3.七氟烷预处理对脑缺血再灌注后Notch信号通路表达的影响雄性C57BL/6小鼠随机分为3组(n=5)：假手术组(Sham)、MCAO组、预处理组(Sevo+MCAO),所有动物于再灌注后2h、24h、72h取脑组织,Western blot检测NICD蛋白含量,Real-time PCR检测Hes1和Hes5靶基因mRNA水平。4. Notch信号通路抑制剂对小鼠局灶性脑缺血损伤的影响雄性C57BL/6小鼠50只随机分为5组(每组n=10)：假手术组(Sham)、溶剂对照组(Vehicle)、DAPT组、七氟烷预处理组(Sevo)、七氟烷预处理联合DAPT组(Sevo+DAPT)。Sevo+DAPT在每次预处理前经腹腔注射给予DAPT 100mg/kg, DAPT组和Vehicle在同一时间分别给予相同容积的DAPT及其溶剂DMSO。所有动物于预处理后24h接受MCAO,再灌注后24h、48h、72h进行神经行为学评分,末次评分后断头取脑测定脑梗死容积百分比。5.RBP-J基因敲除对七氟烷预处理脑保护作用的影响取雄性野生型C57BL/6小鼠(WT)24只、雄性RBP-J基因敲除小鼠(RBP-J-/-)12只,与其同窝出生、性别相同、发育一致的杂合子小鼠(RBP-J+/-)12只,分成4组(n=12)：野生型(WT)、七氟烷预处理(Sevo)、RBP-J基因敲除纯合子(Sevo+RBP-J-+-)、RBP-J基因敲除纯合子(Sevo+RBP-J)。所有动物均接受MCAO 1h,再灌注后24h随机每组取4只小鼠进行多聚甲醛灌注,取脑组织冰冻切片进行Caspase-3染色和TUNEL染色。其余小鼠于再灌注后24h、48h、72h按照进行神经行为学评分；末次评分后进行TTC染色,测定脑梗死容积。结果1.七氟烷预处理减轻脑缺血再灌注损伤与单纯缺血再灌注组相比,七氟烷预处理于再灌注后24h、48h、72h神经行为学评分均有明显提高,再灌注后72h Sevo+MCAO组的神经学评分高于48h组。Sevo+MCAO组小鼠再灌注72h脑梗死容积明显小于MCAO组。2.七氟烷预处理激活Notch信号通路Western blot结果显示重复七氟烷预处理后2h内,Notch受体胞内活性片段NICD蛋白表达迅速增加,预处理后24h,NICD含量仍然高于基础值,但小于2h峰值。Real-time PCR结果显示,Notch靶基因Hesl的mRNA水平在预处理后也明显上升,2h达高峰,24h下降但仍高于基础值。另一靶基因Hes5的mRNA于预处理后2h亦明显增加,但24h时mRNA水平于基础值无统计学差异。3.七氟烷预处理降低缺血再灌注后Notch信号活化峰值七氟烷预处理使缺血再灌注后NICD含量增加,蛋白表达高峰位于再灌注后24h。Sevo+MCAO组NICD含量于再灌注后2h和24h明显高于Sham组(P<0.05),但与单纯缺血再灌注MCAO组相比无统计学差异。再灌注后72h, Sevo+MCAO组NICD含量虽高于Sham组(P<0.05),但显著小于MCAO组(P<0.05),再灌注后NICD蛋白表达高峰下降。脑缺血再灌注后72h内Notch信号靶基因Hes1 mRNA水平持续增高,七氟烷预处理使Hes1mRNA于缺血再灌注后24h也明显高于Sham组(P<0.05)。但与MCAO组无统计学差异。再灌注后72h, Sevo+MCAO组HeslmRNA则明显低于MCAO组72h (P<0.05),脑缺血再灌注后Hesl转录高峰被降低。然而,Sevo+MCAO组Hes5 mRNA水平在再灌注后2h和24h均高于Sham组(P<0.05),72h与基础值无差异,三个时间点Hes5 mRNA水平与MCAO组均无显著性差异。4.DAPT逆转七氟烷预处理脑保护作用七氟烷预处理减小脑梗死容积百分比,诱导脑缺血耐受。单独给予γ-分泌酶抑制剂DAPT或其溶剂,两组小鼠脑梗死体积无差异。而Sevo+DAPT与Sevo相比,脑梗死容积明显增加,与Vehicle组相比无统计学差异。脑缺血后48h和72h,Sevo较Vehicle组神经行为学评分显著提高,而Sevo+DAPT组神经行为学评分则较Sevo降低,与、Vehicle和DAPT无差异。5.RBP-J基因敲除消除七氟烷预处理脑保护作用Sevo+RBP-J-/-组小鼠脑梗死容积百分比较WT显著降低(P<0.05),但与Sevo组比无统计学差异。Sevo+RBP-J-/-与Sevo相比,脑梗死容积则显著增加(P<0.05)。再灌注后24h、48h、72h, Sevo和Sevo+RBP-J+/-组神经行为学评分明显高于WT组(P<0.05),但两组之间无差异。Sevo+RBP-J-/-组神经行为学评分则显著低于Sevo组(P<0.05),与WT组间无差异。脑缺血再灌注后24h行TUNEL及Caspase-3染色,在显微镜下取半暗带皮层进行拍照并比较凋亡阳性神经元数目。Sevo和Sevo+RBP-J+/-组TUNEL和Caspase-3阳性细胞明显少于WT组,两者之间无差异,而Sevo+RBP-J-/-组后凋亡细胞TUNEL和Caspase-3阳性细胞则多于Sevo组,与WT组之间没有显著性差别。结论1. Notch信号通路于脑缺血再灌注后激活,参与脑缺血损伤效应。2.脑缺血再灌注后Notch信号调控STAT3活化,共同介导脑缺血损伤。3.2.5%七氟烷重复预处理可诱导小鼠脑缺血耐受。4. Notch信号通路被七氟烷预处理激活,通过抗凋亡介导脑保护作用。
