细胞质雄性不育(CMS)是油菜杂种优势利用的主要途径。目前,国内外主要应用的油菜CMS系统有ogura CMS和polima CMS,其中ogura系统在欧洲应用较多,国内主要使用傅廷栋教授于1972年发现的polima胞质不育系统。然而,生产上杂交种的胞质单一化存在着潜在风险。因此,鉴定新的细胞质雄性不育类型及其胞质不育基因对于实现杂交种胞质来源多样化具有重要意义。本研究以hau CMS原始芥菜型油菜和转育的甘蓝型油菜保持系和不育系为实验材料,通过对hau胞质线粒体基因及侧翼特异区域进行序列结构及其表达,翻译分析；并进一步通过原核表达及植物遗传转化的方法,对hau胞质特异的异常开放读码框进行功能分析,鉴定hau胞质的不育相关基因。本研究的主要结果如下：1.hau胞质线粒体基因组特异区段的分析通过对不育系线粒体的功能基因侧翼序列进行染色体步移(genome walking)及序列对比分析,发现hau CMS线粒体atp6基因的下游与其芥菜型油菜保持系,甘蓝型油菜保持系存在明显差异。进一步对该区域进行BLAST分析,发现该区域可能包含一异常开放读码框(chimeric open reading frame)——orf288,与已报道的tour胞质的同源区域相似度较高(99.5%)。在所比较的序列内有四个位点的差异,hau CMS相对于tour胞质有三个碱基(485bp,785bp,802bp)的置换和一个碱基(764bp)的缺失,该开放阅读框与甘蓝型油菜油菜nap胞质线粒体orf286同源性为93%。2.hau胞质不育相关区域atp6/orf288的表达分析通过RT-PCR和northern杂交分析,证实了atp6和orf288在不育系线粒体中共转录；对orf288编码的氨基酸序列和结构进行分析,推测其编码的蛋白N端包含3个跨膜区。为了进一步验证orf288在不育系中可以翻译成蛋白,我们合成了ORF288部分氨基酸序列用于制备其特异的多克隆抗体。通过特异的多克隆抗体对不育系线粒体蛋白和花蕾总蛋白进行western杂交,结果表明orf288在hau CMS不育系中翻译成大小约32kD的蛋白。3.ORF288对大肠杆菌宿主菌具有毒害作用细胞质不育基因通过影响线粒体物质和能量代谢而导致植物雄性器官发育异常,而线粒体起源于共生在真核细胞中的细菌。因此,一些研究表明不育基因在大肠杆菌中表达,会抑制大肠杆菌的生长或对其具有致死作用。我们将orf288连入原核表达载体PET32a,在IPTG诱导下在BL21(DE3)菌株中表达。结果表明ORF288对大肠杆菌宿主细胞的增殖具有明显的抑制作用。这一结果说明orf288对大肠杆菌具有毒害作用,可能以同样的方式作用于植物线粒体,并进一步影响雄蕊发育。4.orf288的拟南芥遗传转化植株雄蕊败育为了进一步验证orf288的功能,我们构建了4个植物转化载体：(1)VNO：包含35S启动子,酵母Y187菌株coxⅣ基因的线粒体定位信号和orf288编码序列；(2)VN3：包含拟南芥AP3基因启动子,酵母Y187菌株coxⅣ基因的线粒体定位信号和orf288编码序列；(3) VNⅡ:包含拟南芥AP3启动子序列和orf288开放阅读框；(4)启动子驱动的GUS基因的载体。拟南芥转基因结果表明,VN3和VNII载体80%的转化植株表现为雄蕊败育,而VNO载体和AGUS对照载体转化植株的育性并没有变化。5.ORF288的亚细胞定位拟南芥转化实验表明,orf288在转化植株中表达能够导致植物育性的变化。其中VNⅡ载体转化植株表型与VN3一致。因此,我们推测orf288在细胞质基质中可以行使其功能或其自身可以定位到线粒体(在线粒体外表达)。通过PredSL和TargetP对ORF288氨基酸进行软件预测分析,其N端可能包含一段线粒体定位信号。为了进一步阐明orf288具有自身的线粒体定位信号,我们将其融合在GFP的N端,通过PEG介导的方法转化拟南芥原生质体,拟南芥原生质体瞬时表达结果表明,ORF288不需要外源信号肽协助就可以将自身定位到植物线粒体上。
