ICOSL在儿童中性粒细胞哮喘中的作用研究

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第一部分ICOSL在中性粒细胞哮喘患儿中的作用目的:研究中性粒细胞哮喘患儿外周血及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中ICOSL(inducible co-stimulator ligand)的表达水平,并分析其与其他细胞因子的相关性,探讨ICOSL在中性粒细胞哮喘中表达的临床意义。方法:选取于2014年8月~2016年7月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院并符合诊断标准的哮喘患儿32例,同期在苏州大学附属儿童医院行下呼吸道异物取出术的16例患儿作为对照组。所有患儿均采集住院后24小时内的外周血及入院后肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),收集临床资料。32例哮喘患儿中根据BALF中细胞分类情况以NEU≥50%为中性粒细胞哮喘组(NA组)12例,男8例,女4例,其余为非中性粒细胞哮喘组(A组)20例,男16例,女4例。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血及BALF中ICOSL、IFN-γ、NE、IL-8、MMP9、IL-4的表达水平,分析比较中性粒细胞哮喘组、非中性粒细胞哮喘组及对照组临床特征、ICOSL表达水平与Th1、Th2、Th17型细胞因子的相关性。结果:NA组和A组有湿疹史或过敏原点刺、血过敏原阳性检出者均为75%;NA组平均住院天数11.18±4.29天长于A组的平均住院天数7.55±4.45天,差异有统计学意义(P<0.05);外周血中NA组ICOSL、NE、IL-8、IL-4及MMP9明显高于A组及C组,A组的NE、IL-4浓度也明显高于C组,NA、A组IFN-γ明显低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05);BALF中NA组ICOSL、NE、IL-8及MMP9浓度明显高于A组和C组,A组的MMP9浓度也明显高于C组,A组的NE浓度明显低于C组,NA组、A组IFN-γ浓度明显低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。外周血中ICOSL与IL-8水平相关性较好(r=0.683,P=0.042);BALF中ICOSL与IL-8水平相关性较好(r=0.700,P=0.036)。结论:中性粒细胞哮喘及非中性粒细胞哮喘患儿体内都存在Th1/Th2/Th17的免疫失衡,但这种免疫失衡在中性粒细胞哮喘患儿体内表现的更为严重,临床治疗困难,需要住院治疗时间长。中性粒细胞哮喘患儿外周血及BALF中ICOSL表达均较正常组升高,ICOSL可能是通过调节Th17分泌IL-17,增强IL-8作用使中性粒细胞在气道内募集及NE、MMP9明显增加,参与中性粒细胞哮喘免疫炎症的发生发展。第二部分ICOSL抗体干预在中性粒细胞哮喘小鼠模型中作用的研究目的:研究ICOSL抗体干预在中性粒细胞哮喘小鼠模型中的作用,探讨ICOSL在中性粒细胞哮喘中免疫病理机制及Th1/Th2/Th17失衡中的地位。方法:将SPF级的6周龄Balb/c小鼠,随机分为四组:正常对照组(CON组)、中性粒细胞哮喘组(NEU组)、ICOSL抗体干预组(ICOSL抗体组)和Ig G抗体同型对照组(Ig G组)。NEU组、ICOSL抗体组和Ig G组均给予OVA+LPS致敏及激发(0、7、14天给OVA+LPS腹腔注射致敏,第22天起连续七天OVA雾化吸入30min激发),CON组给同剂量PBS注射和激发。对ICOSL抗体组和Ig G组分别在0、3、7、10、14天腹腔注射ICOSL抗体和Ig G同型对照抗体50μg。各组小鼠末次激发24小时内,摘眼球取血约1 ml EDTA抗凝,左肺进行支气管肺泡灌洗,回收1.5 ml左右肺泡灌洗液,取出新鲜右侧肺脏。采用流式细胞仪检测外周血和肺组织中性粒细胞上ICOSL表达,BALF计细胞总数及分类计数,BALF及外周血细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-13、IL-17检测,肺组织病理学及组织形态学分析。结果:CON组小鼠激发后无行为学变化;NEU组小鼠在第一次激发约5分钟后出现行为学变化,第五次激发开始即出现明显的行为学变化;ICOSL抗体组小鼠在第三次激发开始出现行为学变化,第七次激发行为学表现相对不明显;Ig G组小鼠整体行为学表现较NEU组稍有改善,较ICOSL组明显。四组小鼠外周血中性粒细胞上均有ICOSL表达,NEU组阳性率最高,ICOSL抗体组最低,各组间两两比较,P<0.001;四组小鼠肺组织中性粒细胞上ICOSL均有表达,NEU组阳性率最高,CON组最低,但四组间两两比较差异均无统计学意(P>0.05)。BALF中总细胞数NEU组最高,CON组最低,差异有统计学意义。BALF中中性粒细胞比例CON组最低,其次ICOSL抗体组,NEU组和Ig G组均高,差异有统计学意义(P<0.05)。外周血中,CON组IFN-γ浓度明显高于NEU组、ICOSL抗体组、Ig G组,差异有统计学意义(P<0.05);ICOSL抗体组IL-6浓度最低,NEU组最高,四组组间比较均有统计学差异(P<0.05);CON组IL-13浓度均明显低于NEU组、ICOSL抗体组、Ig G组,差异有统计学意义,(P<0.05);NEU组IL-17浓度均明显高于CON组、ICOSL抗体组、Ig G组,差异有统计学意义(P<0.05)。BALF中,IFN-γ在CON组最高,明显高于NEU、Ig G组,差异有统计学意义(P<0.05),CON组与ICOSL组差异不明显;CON组IL-6最低,与NEU、ICOSL、Ig G组比较差异有统计学意义(P<0.05);IL-13在CON组最低,NEU组最高,两组比较差异有统计学意义,ICOSL抗体组、Ig G组较NEU组有降低,差异有统计学意义(P<0.05);IL-17在NEU组最高,CON组、ICOSL组、Ig G组均低于NEU组,差异有统计学意义(P<0.05)。肺组织HE染色后NEU、Ig G组气管腔狭窄,支气管粘膜上皮水肿、脱落和变性,气管周围及肺组织、肺泡间隔可见中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等浸润明显;ICOSL抗体组小鼠气管管腔粘膜上皮增生及气管周围、肺组织、肺泡间隔炎症细胞浸润情况较NEU、Ig G组改善;PAS染色肺组织粘液,可见NEU、Ig G组粘液分泌明显,ICOSL存在一定程度的粘液分泌但较NEU、Ig G组改善。ICOSL免疫组化分析,NEU、Ig G组小鼠肺泡间质及气道周围ICOSL阳性表达细胞明显多于ICOSL抗体组,ICOSL阳性表达的细胞四组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:中性粒细胞哮喘小鼠模型激发前给予ICOSL抗体干预后使哮喘发作行为学改变发生减缓,发作症状减轻,直至对激发耐受;能减轻气道的炎性细胞浸润及粘液分泌;部分降低外周血及BALF中IL-6、IL-13、IL-17水平及升高IFN-γ水平。表明阻断ICOS/ICOSL信号通路可部分阻断中性粒细胞哮喘的发展历程,可望为哮喘的治疗提供新靶位。
中文摘要第4-8页
abstract第8-11页
前言第14-19页
    参考文献第16-19页
第一部分 ICOSL在中性粒细胞哮喘患儿中的作用第19-35页
    研究方法第20-23页
        一、研究对象第20页
        二、材料第20-21页
        三、方法第21-23页
        四、统计学分析第23页
    结果第23-29页
    讨论第29-32页
    参考文献第32-35页
第二部分 ICOSL抗体干预在中性粒细胞哮喘小鼠模型中作用的研究第35-54页
    研究方法第35-42页
        一、材料第35-37页
        二、方法第37-41页
        三、统计学分析第41-42页
    结果第42-49页
    讨论第49-52页
    参考文献第52-54页
结论第54-55页
综述第55-64页
    参考文献第59-64页
缩略词表第64-66页
攻读硕士期间公开发表的论文第66-67页
致谢第67-68页
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