刚果嗜皮菌选择性分离方法的研究及盘羊分离株的分离鉴定

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刚果嗜皮菌(Dermatophilus Congolensis),属于放线菌目(Actinomycetales)嗜皮菌科(Dermatophilaceae)嗜皮菌属(Dermatophilus)的成员。可通过皮肤感染而引起多种动物以及人的一种急性或慢性皮肤性传染病,以浅表性渗出、脓包性皮疹或结节为主要临床特征。动物感染后可引起生产力以及抗病力下降,绵羊感染后可导致羊毛品质及皮革质量降低,羔羊消瘦及死亡,OIE将本病列为B类疫病。由于刚果嗜皮菌在生长过程中存在孢子期和菌丝期的特性,并且在从病变皮肤中分离时常受到杂菌污染而难以获得纯培养菌,因此建立一种高效、有效的刚果嗜皮菌的分离方法一直是国内外学者关注的技术问题。本研究以分离纯化并鉴定的刚果嗜皮菌绵羊株和发病盘羊病变皮肤为试验材料,采用平板涂抹的方法,研究病料样品的不同的预处理方法、培养基、增菌活化剂、杂菌抑制剂对刚果嗜皮菌的分离效果的影响,以期建立一种用于实验室分离纯化刚果嗜皮菌的高效简便的方法,并在此基础上,对发病盘羊皮肤病料进行刚果嗜皮菌的分离,并对刚果嗜皮菌盘羊分离株进行菌落与形态学鉴定、家兔人感染试验、PCR鉴定及RAPD分析。结果如下:1、皮肤病料在无菌蒸馏水室温静置浸泡15天后,取上清接种于pH7.0 6%酵母膏活化液中,60℃培养30min,再涂于绵羊血液琼脂平板,37℃培养48h,可获得较多的刚果嗜皮菌典型菌落。菌落经染色镜检,可观察到呈不规则状及少量的圆形孢子。而采用将病料悬液经37℃水浴1h、烛罐处理15min均未分离到目地菌;0.05%SDS及0.05%SDS 6%蛋白胨的活化液对病料中的刚果嗜皮菌无活化作用。6%酵母膏的最佳活化温度为60℃30min;刚果嗜皮菌在高氏Ⅰ号培养基上生长不良,在普通营养琼脂培养上不生长,在LB琼脂培养基上的生长情况不如绵羊血液琼脂;常用于放线菌分离培养中防止杂菌生长的孔雀石绿和重铬酸钾抑菌剂,在本试验中无明显抑制杂菌生长的作用,不适合作为刚果嗜皮菌分离培养的选择性抑菌剂。本试验所建立的刚果嗜皮菌分离纯化方法可为动物与人类嗜皮菌病的病原学研究提供有用的技术手段。2、采用本研究建立的刚果嗜皮菌分离方法,从发病盘羊皮肤病料中分离获得刚果嗜皮菌(盘羊株),经培养特性、菌体染色与形态特性、PCR检测、分离株间接免疫酶染色鉴定,以及家兔感染试验均与绵羊分离株相同。说明来自同一地区发病的刚果嗜皮菌绵羊和盘羊分离株的某些生物学特性基本一致。3、对刚果嗜皮菌绵羊株和盘羊株的DNA进行随机引物扩增多态性DNA (RAPD)分析,扩增产物有一定的多态性,根据欧氏遗传距离公式计算出遗传距离为0.6667,显示盘羊株与绵羊株的基因组DNA有不同程度的差异。
摘要第5-6页
Abstract第6页
符号说明—英文缩略词表第9-10页
引言第10-11页
第一篇: 文献综述第11-20页
    第一章 刚果嗜皮菌生物学特性及流行病学的研究进展第11-19页
        1.1 刚果嗜皮菌的分类第11页
        1.2 刚果嗜皮菌的生物学特性第11-13页
        1.3 刚果嗜皮菌的致病机理与发病原因第13页
        1.4 嗜皮菌病的流行现状第13-14页
        1.5 主要临床症状第14-16页
        1.6 诊断与检测以及防治第16-19页
    第二章 刚果嗜皮菌随机引物扩增多态性DNA的分析的研究进展第19-20页
        1.1 RAPD技术第19页
        1.2 刚果嗜皮菌RAPD分析研究的意义第19-20页
第二篇: 试验部分第20-34页
    试验一 刚果嗜皮菌选择性分离方法的研究第20-25页
        1. 材料与方法第20-22页
            1.1 材料第20-21页
                1.1.1 病料来源及处理第20页
                1.1.2 参考菌株第20页
                1.1.3 培养基的配制第20页
                1.1.4 含抑菌剂培养基的配制第20页
                1.1.5 其他试剂和主要用品第20-21页
            1.2 方法第21-22页
                1.2.1 培养基的选择第21页
                1.2.2 活化剂和活化温度的选择第21页
                1.2.3 抑菌剂的选择第21页
                1.2.4 病料的处理第21-22页
        2. 结果第22-23页
            2.1 培养基的选择第22页
            2.2 抑菌剂的选择第22页
            2.3 活化剂和活化温度的选择第22-23页
            2.4 滤器过滤处理和水浴处理及烛罐处理第23页
            2.5 浸泡处理第23页
        3 讨论第23-25页
    试验二 刚果嗜皮菌盘羊株的分离鉴定第25-30页
        1 材料与方法第25-27页
            1.1 分离培养第25页
                1.1.1 皮肤病料第25页
                1.1.2 主要试剂与仪器第25页
                1.1.3 刚果嗜皮菌盘羊株的分离培养第25页
            1.2 刚果嗜皮菌盘羊株间接免疫酶染色方法第25-26页
                1.2.1 阳性菌株及阴性菌株第25页
                1.2.2 主要试剂与仪器第25-26页
                1.2.3 免疫笔的自制第26页
                1.2.4 玻片的处理第26页
                1.2.5 染色方法第26页
            1.3 刚果嗜皮菌盘羊株PCR鉴定第26-27页
                1.3.1 主要试剂与仪器第26页
                1.3.2 基因组DNA的快速提取第26-27页
                1.3.3 PCR扩增反应引物设计第27页
                1.3.4 PCR扩增反应第27页
            1.4. 刚果嗜皮菌盘羊株对家兔的致病性测定第27页
                1.4.1 试验菌株第27页
                1.4.2 试验动物与分组第27页
                1.4.3 人工感染方法第27页
        2 结果第27-29页
            2.1 刚果嗜皮菌盘羊株的分离第27页
            2.2 间接免疫酶标染色鉴定结果第27-28页
            2.3 PCR检测结果第28-29页
            2.4 家兔人工感染结果第29页
        3 讨论第29-30页
    试验三 刚果嗜皮菌RAPD多态性分析第30-34页
        1. 材料与方法第30-32页
            1.1 试验菌株第30页
            1.2 引物来源第30页
            1.3 主要试剂和仪器第30页
            1.4 方法第30-32页
                1.4.1 基因组DNA的快速提取第30-31页
                1.4.2 RAPD-PCR扩增反应第31-32页
                1.4.3 多态性分析第32页
        2 结果第32-33页
            2.1 RAPD-PCR扩增反应第32页
            2.2 刚果嗜皮菌RAPD-PCR多态性第32页
            2.3 相异系数以及遗传距离的计算第32-33页
        3 讨论第33-34页
全文小结第34-35页
主要创新点第35-36页
参考文献第36-40页
致谢第40-41页
作者简介第41-42页
导师评阅表第42页
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