BMSCs-庆大霉素—藻酸钙三维缓释微球修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

科技发展，社会进步，人们生活质量和平均寿命不断提高，人类已经步入老龄化社会。老龄化社会给我们带来一系列的挑战，其中，关节软骨的磨损、退变，甚至关节软骨的剥脱、缺损，是运动医学亟待解决的热点问题。此外，工业革命使我们的生活更趋便捷，各种交通事故等高能量损伤也日益增加，临床中常见到膝髋等关节软骨大面积缺损，甚至合并开放性损伤，给关节外科带来发展的机遇。关节软骨存在先天不足，其不受神经支配，缺乏血液供应，软骨细胞自身增殖能力很低，以致损伤软骨的自身修复能力非常有限；一旦关节软骨损伤，难以自行修复；此外，关节软骨生存在一个相对封闭的关节腔内，主要靠滑膜维持关节腔内环境的稳定，受外周循环的影响极低；一旦污染，难以快速清除。对于关节疾病，常需要更大剂量更长疗程的全身应用抗生素等药物，疗效不确切的同时药物副作用成为最大威胁；虽然关节腔内注射抗生素等药物能提高局部药物浓度，减少静脉给药的副作用，但是常需要反复穿刺和严格无菌操作，有潜在关节腔内感染的高风险，因此，关节软骨损伤在修复过程中难以维持自身微环境的稳定和自我修复，若合并关节感染更是灾难性病症！本课题通过体外构建BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球培养体系，了解该缓释微球的药物缓释情况，观察庆大霉素对BMSCs软骨细胞分化的影响；并建立动物模型验证该缓释微球修复软骨的短期效果，为临床开放性软骨缺损，或伴关节内感染的修复研究建立实验基础。目的1．掌握体外BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球构建的技术；掌握建立关节软骨缺损的动物模型和自体骨膜覆盖组织工程软骨移植修复技术。2．观察庆大霉素在体外三维缓释微球中的释放情况；及其对BMSCs软骨分化的影响。3．在兔膝关节软骨缺损模型中，植入BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球，观察其对关节软骨缺损的短期修复效果。4．为开放性或感染性软骨缺损的修复提供实验基础，为进一的步临床软骨修复提供基础性研究。方法1．BMSCs的来源严格无菌条件下，自四周龄新西兰兔的髂后上嵴各抽取骨髓1-1.5ml，采用密度梯度离心法并结合贴壁筛选法分离、纯化BMSCs，并进行体外平面培养扩增，对细胞表型、纯度进行鉴定。2．制备庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球准确称取3.0g庆大霉素，溶于10ml双蒸水中，在酸碱测试仪上，用4mol/L氢氧化钠液滴定溶液的PH值至7.4，依次加入10μl的HEPES缓冲液、0.0875g的氯化钠、三倍标准浓度藻酸钠液20ml，即配制成含庆大霉素3.0的庆大霉素-藻酸钠凝胶30ml，其中藻酸钠为二倍标准浓度；抽取不同组别藻酸钠凝胶10ml，滴到装有氯化钙溶液40ml、5mmol/L的HEPES缓冲液，PH为7.4的培养皿中，凝珠聚化呈乳白色或透明淡黄色。将装有检测样本的透析袋放置在已加入100ml0.9%氯化钠溶液的密闭容器中，置于摇床，设定各个时间段，精确抽取10ml浸泡液作为检测样品，取样送金黄色葡萄球菌抑菌检测，计算凝珠的包封率、药物释放率，并立即向容器中补加0.9%氯化钠液10ml，始终保持容积不变。3．BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释凝珠的构建精确称取3.0g庆大霉素，溶解于10ml的双蒸水中；在酸碱度测试仪上，用4mol/L氢氧化钠滴定至溶液PH值至7.4，加入HEPES缓冲液10μl，0.0875g氯化钠，搅拌使其混匀；再加入三倍标准浓度的藻酸钠液20ml，即配制成含庆大霉素3.0g的庆大藻酸钠凝胶30ml。取0.5ml兔第二代BMSCs悬液，滴入2ml的庆大霉素-藻酸钠凝胶，充分混匀后，即成BMSCs-庆大霉素-藻酸钠凝胶。与BMSCs-藻酸钙三维凝珠培养进行比较。观察BMSCs的形态、生长增殖及其表型变化。4．三维缓释微球的移植将BMSCs-庆大霉素-藻酸钙凝珠填塞在兔膝关节软骨缺损处，采用自体同侧胫骨上段内侧骨膜缝合固定。5．建立兔膝关节软骨缺损模型和实验分组选12只健康新西兰兔，用直径5mm钻头钻直径为5.0mm的全层软骨缺损创面，深度约5mm。分成实验组（BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球移植组）；实验对照组（BMSCs–藻酸钙三维微球移植组）；单纯骨膜覆盖组；空白对照组（不做任何处理）共四组。术后12周处理实验动物，切取实验侧股骨髁以远骨质，对软骨缺损处修复组织进行大体和光镜观察，对组织切片行HE染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果1．传代的BMSCs贴壁能力很强，经体外平面扩增的细胞大小、形态相似，多呈纺锤形或短梭形；免疫组织化学检测结果显示：第1-3代BMSCs不表达CD34，而表达CD44、CD105；Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阴性，提示是未分化的BMSCs。2．本实验中使用金黄色葡萄球菌菌株及培养皿均是按标准严格控制，所得结果具有明显的可比性，为实验的准确性提供肯定性依据。各组庆大霉素-藻酸钙缓释微球在30天的检测期内均能到达金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）>2μg/ml，其中，U组庆大霉素的包封率较高，30天释放庆大霉素的累计释放总量较大。3．在BMSCs-庆大霉素-藻酸盐三维缓释微球中，BMSCs的生物学活性表现良好。大体观察和倒置显微镜观察结果均显示，BMSCs生长状态较好，生长曲线比较正常；三维缓释微球培育2周后，Ⅱ型胶原染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性，为软骨细胞表型。这与BMSCs-藻酸钙三维微球的培育结果一致。4．成功建立兔膝关节股骨髁关节面软骨缺损的动物模型。12只健康新西兰兔术后12周均成活。实验组软骨缺损面由乳白色组织填充，与周边组织色泽相近，界限清晰，无明显间隙。组织切片可见两侧都与周围软骨组织愈合，未见载体材料的残留，细胞呈圆形，周围已形成软骨陷窝；但细胞数目明显多于正常组织，且排列紊乱。Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色为阳性；实验对照组与实验组结果一样；单纯骨膜覆盖组修复组织呈白色，表面凹陷，与周围组织境界清晰，细胞呈成纤维细胞样改变，表面粗糙凹陷，与周围组织愈合差，底部少量骨组织形成。Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性；空白对照组缺损区明显凹陷，底部可见粉红色肉芽组织增生，未见明显软骨组织充填。结论1．BMSCs存在于骨髓组织，取材方便，细胞贴壁能力很强，通过密度梯度离心法，并结合贴壁筛选法，分离、纯化兔骨髓间充质干细胞。经检测，CD44、CD105抗体免疫组化染色均呈阳性，Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色呈现阴性，这些生物学特征与BMSCs一致。通过该混合方法能成功获取更高纯度、未分化的BMSCs。2．藻酸钙缓释微球是良好的抗生素缓释载体，三组庆大霉素藻酸钙缓释微球，在大部分30天各检测时间段中，庆大霉素的释放浓度都高于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（2μg/ml）。含10%庆大霉素的U组缓释微球具有相对最好的包封率和最大的药物释放量，与庆大霉素骨水泥相似，是BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释凝珠的最佳三维载体支架。由于该支架的组织降解性，庆大霉素的早期释放情况比抗生素骨水泥好。3．在庆大霉素缓慢释放的状态下，BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球使BMSCs保持较好的生物学形态，生长增殖正常，培养至第7-21天，BMSCs增殖最明显，最后分化为软骨细胞；Ⅱ型胶原抗体免疫组化和甲苯胺蓝染色结果均呈阳性改变，且与BMSCs-藻酸钙三维微球培育结果一致。该三维微球体外培育具有良好的组织相容性，能达到BMSCs软骨化的需要。4．在体内，BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释微球移植组和BMSCs-藻酸钙三维微球移植组能得到相同的软骨缺损修复效果。进而说明，在体内复杂的环境下，BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释凝珠的各成分之间具有良好的组织相容性，能给BMSCs的增殖和其向软骨细胞的分化提供良好的内在微环境；藻酸钙具有良好的可降解性，无任何残留。体外培养的BMSCs-庆大霉素-藻酸钙三维缓释凝珠，对关节软骨损伤动物模型的短期修复效果良好。