ATP敏感性钾通道开放剂对尿酸肾脏损伤的保护作用及其分子机制的研究

肾脏疾病患者肾小球滤过率降低、尿酸排泄减少，导致尿酸升高[1]，因此，尿酸一直被认为仅是肾功能降低的标志。近期研究表明，尿酸水平升高，促进肾脏疾病的发生和发展[2]。在未进行治疗的痛风患者中，25%患者死于肾功能衰竭，此外，25%患者出现蛋白尿，50%-65%患者菊粉清除率降低，70%-80%患者肾血流量减少，95%患者出现慢性肾功能衰竭的组织学变化[3]。由此可见，高尿酸血症可引发、加重或预测肾脏疾病[1,4-7]；反之，肾脏损伤减弱肾脏排泄尿酸的能力，二者之间形成恶性循环。肾脏疾病进一步发展成为终末期肾病，对患者和社会造成了沉重的经济负担。现今，美国每年为治疗33.3万名终末期肾病患者花费100多亿美元[8]。现有的治疗方法，保护肾脏的作用还远远不够：肾素-血管紧张素系统抑制剂并不能抑制出现蛋白尿患者的肾脏疾病的恶化[9-10]；利尿剂，低剂量阿司匹林会升高血尿酸水平[8,11]；血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，例如氯沙坦，可以通过抑制尿酸转运蛋白-1（urate transporter-1, URAT-1）促进尿酸排泄，降低正常人和高血压患者的血尿酸水平。但是，不同的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对尿酸的作用不同，一些药物对血尿酸水平没有影响[12-14]。因此，有必要寻找抑制肾脏疾病发展的新途径。实验室前期研究表明：埃他卡林（iptakalim, Ipt）为新结构类型的ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channels, KATP)开放剂（potassium channel opener, KCO），对高尿酸血症所致肾损伤具有强效保护作用，其药理学机制与其抗高血压作用、改善内皮功能紊乱密切相关，从而提高肾脏代谢尿酸的能力，降低血尿酸水平[15]。大量临床研究表明：心血管和肾脏疾病患者中内皮功能障碍是非常普遍的现象。参与内皮功能紊乱的重要机制包括：一氧化氮（nitric oxide, NO）分泌减少；内皮素生成增多；粘附分子过表达。埃他卡林改善内皮功能紊乱的分子途径与其下调血浆内皮素水平病理性增高；促进血管内皮细胞合成分泌NO，抑制由尿酸（uricacid,UA）诱导的单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）、细胞间粘附因子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（vascularcell adhesion molecule-1, VCAM-1） mRNA表达上调等有关[16]。提示埃他卡林是一种适用于高尿酸血症所致高血压和肾损伤患者的抗高血压药物。此外，埃他卡林改善内皮细胞功能障碍，对高血压肾损伤、缺血再灌注肾损伤具有较强的保护作用[17-18]。然而，埃他卡林对肾脏细胞是否具有直接保护作用尚不清楚。肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞是构成肾单位的三种重要细胞类型，都参与了肾脏疾病的病理生理过程[19-22]。生理学和分子生物学研究表明肾脏存在不同的KATP通道，且KATP通道在肾脏生理调节过程中，对维持钾离子的稳态和肾脏微血管张力起着重要作用[23]。在病理状态下，KATP结构和功能的改变与肾功能的改变密切相关[24-25]。KATP并不是一个单一的通道类型，它是由内向整流亚基（Kir）和调节性磺脲受体（SUR）组合而成的八聚体。不同的组织或同一组织的不同区域KATP的分子亚型也有差异。其中SUR2B/Kir6.1型KATP通道均存在于肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞[26-29]。埃他卡林为新结构类型的KCO，它对SUR2B/Kir6.1型KATP通道的开放作用强，具有一定的亚型选择性，对SUR2A/Kir6.2型作用较弱，对SUR1/Kir6.2型无激活作用[30]。因此，我们推测，埃他卡林可以激活KATP通道，对肾脏细胞起到直接保护作用。纳他卡林（natakalim,Nat）是以埃他卡林为先导化合物合成的新衍生物，纳他卡林能选择性开放SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道，对SUR1/Kir6.2和SUR2A/Kir6.2亚型没有作用，具有很高的选择性。二氮嗪（diazoxide, Dia）是经典的ATP敏感性钾离子通道开放剂，可非选择性激活SUR1, SUR2A, SUR2B，其亚型激活作用的次序为，SUR2A/Kir6.2>SUR2B/Kir6.1>SUR1/Kir6.2，其中对SUR2A激活作用更强。两药为进一步探讨埃他卡林对肾脏直接作用的药理学机制，提供了良好的实验工具。本实验在前期研究工作的基础上，首先在尿酸所致肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞损伤的模型上，研究埃他卡林对肾脏细胞的保护作用，并与其他KCO类药物纳他卡林和二氮嗪的药理作用进行对比；结合KATP拮抗剂格列苯脲的拮抗效应，分析埃他卡林对肾脏细胞保护作用的药理学特征。实验进一步探讨了埃他卡林激活细胞膜KATP保护肾脏细胞的分子途径。进而总结了埃他卡林肾脏保护作用的药理学特征及作用机制。本研究将为埃他卡林发展成为治疗肾脏损伤的药物、探讨其临床适应症提供实验依据。第一部分：ATP敏感性钾通道开放剂对尿酸所致肾脏细胞损伤的保护作用利用MTT法和流式细胞术观察了细胞存活的情况，分析了ATP敏感性钾通道开放剂埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪抗尿酸所致肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞损伤作用的药理学特征。一、尿酸对肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞的损伤600mg/l尿酸可显著性降低肾小球内皮细胞存活率。而1200mg/l尿酸可降低肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞的存活率。可见1200mg/l尿酸对三种肾脏细胞具有明显的损伤作用，可用于后续实验。二、ATP敏感性钾通道开放剂和拮抗剂对肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞存活率的影响10μM埃他卡林、纳他卡林、二氮嗪和格列苯脲分别作用于肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞48h后，细胞存活率与空白对照组相比，不存在显著性差异。说明单独给予上述四种药物对肾脏细胞的存活率无影响。三、ATP敏感性钾通道开放剂对尿酸所致肾脏细胞损伤的影响0.1-100μM埃他卡林、纳他卡林，及0.01-100μM二氮嗪可升高尿酸所致肾小球内皮、系膜细胞损伤模型中的细胞存活率。埃他卡林和纳他卡林在10-100μM浓度范围内，可升高尿酸所致肾小管上皮细胞损伤模型中的细胞存活率，而二氮嗪在肾小管上皮细胞中无此作用。埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪减轻尿酸所致肾脏细胞损伤的作用可被KATP拮抗剂格列苯脲所拮抗。提示ATP敏感性钾通道开放剂保护肾脏细胞的作用与激活KATP有关。第二部分：ATP敏感性钾通道开放剂保护肾脏细胞的分子机制一、ATP敏感性钾通道开放剂对肾脏细胞SUR2B/Kir6.1基因和蛋白表达的调控通过RT-PCR,免疫荧光技术证实了SUR2B/Kir6.1在肾脏细胞中的表达。同时应用了Western Blot技术研究尿酸诱导肾脏细胞损伤模型中，KATP蛋白表达的特征以及ATP敏感性钾通道开放剂的调节作用，为进一步阐明ATP敏感性钾通道开放剂的作用靶标提供实验依据。1200mg/l尿酸可上调肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞中SUR2B和Kir6.1的蛋白表达。10μM埃他卡林可下调受损肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞中SUR2B和Kir6.1蛋白表达，10μM纳他卡林可以模拟其作用。10μM二氮嗪可抑制尿酸诱导的肾小球内皮、系膜细胞中SUR2B和Kir6.1蛋白表达的上调，但对肾小管上皮细胞中的SUR2B和Kir6.1蛋白表达无影响。埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪下调受损肾脏细胞中SUR2B，Kir6.1蛋白表达的作用可被KATP特异性拮抗剂格列苯脲所拮抗。二、ATP敏感性钾通道开放剂对肾脏细胞内钙离子浓度的影响由于荧光探针易淬灭，因此采用过氧化氢快速模拟尿酸的氧化应激作用。通过实时监测细胞内钙离子浓度，研究埃他卡林对肾脏细胞功能的影响，并将埃他卡林与纳他卡林和二氮嗪的药效进行对比，同时观察KATP拮抗剂格列苯脲对埃他卡林等效应的影响，分析其作用靶标。（一）过氧化氢对肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞内钙离子浓度的影响0.3%过氧化氢可显著性升高肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞内钙离子浓度，可用于后续实验。（二）ATP敏感性钾通道开放剂和拮抗剂对肾脏细胞内钙离子浓度的影响10μM埃他卡林、纳他卡林、二氮嗪和格列苯脲分别作用于肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞，发现其对肾脏细胞内钙离子浓度无影响。（三）ATP敏感性钾通道开放剂对过氧化氢升高肾脏细胞内钙离子浓度的影响0.3%过氧化氢可显著性升高肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞内钙离子浓度。10μM埃他卡林可抑制三种肾脏细胞内钙离子浓度的病理性增高，10μM纳他卡林可以模拟其作用。10μM二氮嗪可抑制肾小球内皮、系膜细胞内钙离子浓度的病理性升高，但在肾小管上皮细胞中无此作用。埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪抑制钙超载的作用可被KATP拮抗剂格列苯脲所拮抗，表明与细胞膜KATP激活有关。三、ATP敏感性钾通道开放剂对肾脏细胞一氧化氮释放的影响由于荧光探针易淬灭，因此采用过氧化氢快速模拟尿酸的氧化应激作用。通过实时监测细胞释放NO水平，研究埃他卡林对肾脏细胞功能的影响，并将埃他卡林与纳他卡林和二氮嗪的药效进行对比，同时观察KATP拮抗剂格列苯脲对埃他卡林等效应的影响，分析其作用靶标。（一）ATP敏感性钾通道开放剂和拮抗剂对肾脏细胞一氧化氮释放的影响10μM埃他卡林、纳他卡林、二氮嗪和格列苯脲分别作用于肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞，发现二氮嗪、格列苯脲对肾脏细胞一氧化氮的释放无影响。埃他卡林、纳他卡林可以显著性抑制肾小管上皮释放一氧化氮，而对肾小球内皮、系膜细胞无影响。（二）ATP敏感性钾通道开放剂对过氧化氢抑制肾脏细胞一氧化氮释放的影响0.3%过氧化氢可显著性抑制肾小球内皮、系膜和肾小管上皮细胞NO的释放。10μM埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪均可促进受损肾小球内皮细胞释放NO，该作用可被KATP拮抗剂格列苯脲所拮抗，表明与细胞膜KATP激活有关。三种药物对受损肾小球系膜和肾小管上皮细胞NO的释放无影响。四、ATP敏感性钾通道开放剂对尿酸诱导的单核细胞-内皮细胞粘附的影响在尿酸所致肾脏小球内皮细胞损伤模型上，通过荧光探针技术观察单核细胞对内皮细胞的粘附情况，研究埃他卡林对肾脏小球内皮细胞功能的影响，并将埃他卡林与纳他卡林和二氮嗪的药效进行对比，同时观察KATP拮抗剂格列苯脲对埃他卡林等效应的影响，分析其作用靶标。1200mg/l尿酸可显著性促进单核细胞-肾小球内皮细胞的粘附。10μM埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪均可抑制尿酸诱导的单核细胞-肾小球内皮细胞的粘附，该作用可被KATP拮抗剂格列苯脲所拮抗，表明与细胞膜KATP激活有关。五、ATP敏感性钾通道开放剂对尿酸诱导肾小球内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1的影响在尿酸所致肾小球内皮细胞损伤模型上，通过酶联免疫吸附法观察肾小球内皮细胞分泌MCP-1情况，研究埃他卡林对肾小球内皮细胞功能的影响，并将埃他卡林与纳他卡林和二氮嗪的药效进行对比，同时观察KATP拮抗剂格列苯脲对埃他卡林等效应的影响，分析其作用靶标。1200mg/l尿酸可显著性促进肾小球内皮细胞分泌MCP-1。10μM埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪均可抑制受损肾小球内皮细胞分泌MCP-1，该作用可被KATP拮抗剂格列苯脲所拮抗，表明与细胞膜KATP激活有关。六、ATP敏感性钾通道开放剂对尿酸刺激肾小球内皮细胞NFκB核转位的作用在未刺激状态下，NFκB与抑制蛋白IkBα结合以无活性形式存在于细胞的胞浆中。感受激活信号后，IκBα被磷酸化，通过泛素化途径而降解， NFκB随即通过核孔复合体上的受体进入细胞核中，结合于靶基因的启动子或增强子上，迅速诱导靶基因mRNA的合成。为证明激活KATP是否抑制炎症通路，我们应用免疫荧光技术检测了NFκB的核转位。结果表明，肾小球内皮细胞受到尿酸刺激后，NFκB从胞浆转位到胞核，当提前给予ATP敏感性钾通道开放剂，再用尿酸刺激肾小球内皮细胞，减少了NFκB转位到胞核。KATP拮抗剂格列苯脲可以逆转其作用。综上所述，本研究首次证实了新型KCO埃他卡林对尿酸所致肾脏细胞损伤具有直接保护作用，且存在一定的细胞差异性，其中对肾小球内皮细胞、肾小球系膜细胞的保护作用较强，对肾小管上皮细胞保护作用较弱。纳他卡林可以模拟埃他卡林的效应。二氮嗪对肾小球内皮、系膜细胞的保护作用强于埃他卡林和纳他卡林，但对肾小管上皮细胞无影响。埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪对肾脏细胞的保护作用与其激活细胞膜KATP通道，下调KATP蛋白表达密切相关，其分子途径包括：下调肾脏细胞内钙离子浓度的病理性增高；促进肾小球内皮细胞NO的释放，抑制NFκB的核转位，减少MCP-1的分泌及单核细胞对内皮细胞的粘附。结合前期实验室研究发现和本实验结果，埃他卡林适用于高尿酸血症伴高血压且有肾脏损伤的患者，该类患者是埃他卡林的强临床适应症；其药理学途径包括：调控血压、保护血管内皮细胞和保护肾脏细胞。埃他卡林还适用于防治高血压性肾脏损伤和缺血再灌注肾脏损伤。本研究为埃他卡林发展成为治疗肾脏损伤的药物、确定其临床适应症提供了实验依据；同时也为抗肾脏损伤药物治疗新靶标的研究提供了实验线索。