随着人们生活水平的提高,肥胖人口在全球范围内不断增多,肥胖诱发的相关疾病也日趋严重,威胁着人类的健康,加重了社会负担。肥胖的产生主要是由于摄入的热量过多,在体内形成脂肪堆积造成的。在维持机体能量平衡的过程中,下丘脑发挥了关键的作用。前期研究发现,下丘脑能够释放具有刺激或抑制摄食作用的神经多肽,如神经肽Y (NPY)和a-黑色素细胞刺激促激素(a-MSH)等,通过调控摄食行为维持机体能量平衡。随着研究的深入,不断有新的信号蛋白被发现对肥胖的产生发挥了重要作用,以往的理论已不能完全解释肥胖产生的原因。目的：本研究旨在通过对DIO和DR大鼠下丘脑的蛋白组学研究,筛选并鉴定下丘脑差异表达的蛋白质,揭示下丘脑内摄食相关蛋白质和神经肽在肥胖发展过程的作用,为肥胖的防治提供新的靶标。方法：1.建立DIO-DR大鼠模型。2.采用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)的技术筛选并鉴定DIO-DR大鼠下丘脑差异表达的蛋白质。3.进一步运用荧光差异双向电泳(two-dimensional differential in-gel eletrophoresis,2D-DIGE)结合串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)的技术筛选并鉴定DIO-DR大鼠下丘脑差异表达的蛋白质。4.利用免疫组化和western blotting的方法对DIO-DR大鼠下丘脑部分差异表达蛋白质(包括PDI、GSTM1、SNAP-25等)进行定位和定量的检测,并对其功能展开深入研究。结果：.DIO和DR大鼠表型差异：1.DIO大鼠与DR大鼠初始体重相当,给予高脂饮食后,DIO大鼠体重增长速度快于DR大鼠,每日平均摄食量多于DR大鼠。2.DIO大鼠腓肠肌、睾丸和心脏的重量与DR大鼠相当,而内脏脂肪含量如附睾、肾周脂肪重量明显高于DR大鼠。3.DIO大鼠的甘油三酯、自由脂肪酸水平高于DR大鼠,而DR大鼠与普通饲料对照组水平相当。4. Elisa检测发现在肥胖早期(4周)和中期(8周)DIO大鼠的血清瘦素、胰岛素水平与对照组和DR组相比没有明显差异；而在肥胖后期(14周)DIO大鼠血清瘦素、胰岛素水平明显高于DR组(p<0.05),DR大鼠水平与对照组无显著性差异,提示DIO大鼠长期高脂喂养后出现瘦素抵抗和胰岛素抵抗。二.2DE结合质谱技术对DIO-DR大鼠下丘脑进行差异表达蛋白质的筛选和鉴定：1.筛选并鉴定出22种蛋白质,其中7种在DIO组呈高表达,7种下调,6种在DR组高表达,6种下调。2.这22种蛋白质分别属于抗氧化蛋白(PRDX1, GSTM1)、细胞代谢相关蛋白(UCHL-1X)、细胞周期调控蛋白、细胞骨架蛋白及未知蛋白等不同类别。三.2D-DIGE结合串联质谱对DIO-DR大鼠下丘脑进行差异表达蛋白质的筛选和鉴定：1.运用2D-DIGE筛选出42个蛋白质点,运用串联质谱技术(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定出33种蛋白质,其中DIO组与对照组相比表达上调的有9个,下调的有2个；DIO组与DR组相比表达上调的有8个,下调的有9个；DR组与对照组相比上调的有8个,下调的有4个。2.将2D-DIGE结合串联质谱技术与2DE结合质谱技术进行比较发现,2D-DIGE所需样品量少,敏感性和特异性更高,筛选出更多的差异蛋白质点。而串联质谱技术也比一级质谱鉴定出更准确的蛋白质结构,得到更信服的结果。这33个蛋白质其中部分与2DE结合一级质谱的鉴定结果相一致,主要包括抗氧化蛋白、分子伴侣、细胞代谢相关蛋白、突触相关蛋白、细胞骨架蛋白等几个类别,其中抗氧化蛋白1(PRDX1X)、谷胱甘肽转移酶1(GSTM1X)、二硫键异构酶(PDI)、泛素C末端水解酶L1 (UCHL1)等可能与肥胖的发生有密切的联系,并发现了动力蛋白1(Dynamin 1)和SNAP-25等新的信号蛋白。四.免疫组化和western boltting方法对差异蛋白质进行定位和定量的研究1.免疫组化发现PDI、PRDX1和Dynamin1在DIO大鼠下丘脑阳性表达增强；SNAP-25在DIO大鼠下丘脑表达下调,在DR大鼠下丘脑表达上调。2. western blotting检测发现Dynamin1在DIO组表达上调,与对照组和DR组相比具有显著性差异；PDI、PRDXl和GSTM1在DIO组表达上调且在DR组表达下调(与对照组相比);UCHL-1和SNAP-25在DIO组表达下调且在DR组表达上调(与对照组相比)。结论：1.成功建立了DIO-DR大鼠模型,与人类肥胖具有很多相似的特征。2.通过蛋白质组学的研究,成功筛选和鉴定了DIO和DR大鼠下丘脑差异表达蛋白,而DIGE技术的应用,发掘了更多肥胖相关的信号分子,为深入研究肥胖的发病机制奠定了基础。3.DIO大鼠下丘脑由于长期高脂饮食发生细胞应激反应(氧化应激和内质网应激),干扰了瘦素和胰岛素的信号转导通路,造成DIO大鼠瘦素抵抗和胰岛素抵抗,并进而发展为肥胖。
