脂质代谢中活性蛋白的结构与功能研究--1. 人载脂蛋白A-V(apoA-V)及其缺失突变体的结构与功能研究 2. 小鼠脂质营养不良相关蛋白lipin1的功能研究

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第一部分人载脂蛋白A-Ⅴ(apoA-Ⅴ)及其缺失突变体的结构与功能研究实验背景:高甘油三酯血症是冠心病发生的独立危险因素,而血浆甘油三酯(triglyceride,TG)水平是由非遗传因素(如肥胖、饮食、酗酒、吸烟等)和遗传因素共同决定的,其中遗传因素约占21~40%。载脂蛋白A-Ⅴ(apolipoprotein A-Ⅴ,apoA-Ⅴ)基因位于载脂蛋白A-Ⅰ/C-Ⅲ/A-Ⅳ基因簇内,含有4个外显子和编码366个氨基酸。ApoA-Ⅴ主要由肝脏合成,切除信号肽后,分泌到血浆,主要分布在高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL),少量分布在极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)和乳糜微粒(chylomicron,CM)。研究显示,apoA-Ⅴ基因敲除小鼠血浆TG水平是对照小鼠的4倍;而apoA-Ⅴ转基因小鼠血浆TG水平比对照小鼠降低约1/3。另外,基因敲除小鼠血浆VLDL水平升高,而在转基因小鼠降低。一些独立的研究已经表明,apoA-Ⅴ特定单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与人甘油三酯水平密切相关。这些研究显示apoA-Ⅴ是一个重要的血浆甘油三酯水平决定因子和一个主要的冠心病危险因素。ApoA-Ⅴ通过激活LPL发挥降甘油三酯作用的结论,还存在争议。ApoA-Ⅴ可以结合脂质(如DMPC),形成直径大约15-20nm的圆盘状复合物。已有研究表明,ApoA-Ⅴ在大肠杆菌内表达为包涵体,变性条件下纯化后,普通PH条件下,溶解度较低(<0.1mg/ml);极端PH条件(50mM枸橼酸钠,PH3.0)下,溶解度提高;在此条件下,ApoA-Ⅴ二级结构中α螺旋占32%。实验目的:本研究对人apoA-Ⅴ和及其不同部位发生大片段缺失的突变体的二级结构和功能进行了研究和比较,以观察不同部位的序列对apoA-Ⅴ蛋白的结构和功能的影响;我们希望这些问题的解答能够对我们更深入、更全面的认识apoA-Ⅴ降甘油三酯的机制有所帮助。实验方法:根据预测的二级结构和疏水性特征,通过DNA重组,将apoA-Ⅴ按6部分依次进行缺失,产生一系列apoA-Ⅴ缺失突变体:A-Ⅴ(△(1-51))、A-Ⅴ(△(51-128))、A-Ⅴ(△(132-188))、A-Ⅴ(△(192-238))、A-Ⅴ(△(246-299))、A-Ⅴ(△(301-343)),利用pET原核表达系统表达成熟型及突变的apoA-Ⅴ蛋白,复性后进行Ni2+亲和柱纯化,获得多肽链C-末端带有6个组氨酸标签(6×His tag)的高纯度蛋白(纯度>90%)用于下面的结构和功能实验。我们利用圆二色实验分析apoA-Ⅴ的二级结构和盐酸胍变性过程;浊度澄清实验分析野生型apoA-Ⅴ和缺失突变体与脂质结合的动力学特点,寻找能与脂质特异结合的片段;脂蛋白脂酶激活实验用于明确apoA-Ⅴ是否对脂蛋白脂酶有激活作用,进一步确定发挥激活作用的片段。实验结果:圆二色(CD)实验:ApoA-Ⅴα螺旋含量为46.26±5.08%。盐酸胍诱导的化学变性圆二色(CD)实验显示,apoA-Ⅴ的变性标准自由能(△GD0)为1.94 kcal/mol apoA-Ⅴ,变性中点盐酸胍浓度(D1/2)为2.02±0.19M。浊度澄清实验:分别在第192至238位间和第301至343位间片段缺失的突变体,即A-Ⅴ(△(192-238))和A-Ⅴ(△(301-343)),的浊度澄清速率常数k1/2值都明显小于apoA-Ⅴ(P<0.05),尤其是A-Ⅴ(△(192-238))突变体降低更为显著,提示这些缺失突变影响了apoA-Ⅴ多肽链与磷脂的相互作用,从而破坏蛋白与脂质的结合。A-Ⅴ(△(56-227))突变体浊度澄清速率常数k1/2值接近A-Ⅴ(△(192-238)),进一步印证前述实验结果。而A-Ⅴ(△(51-128))和A-Ⅴ(△(132-188))突变体的k1/2值显著大于apoA-Ⅴ(P<0.05),提示缺失这两部分促进了apoA-Ⅴ与脂质的结合。其它各突变体的脂质结合动力学与apoA-Ⅴ无明显差异(p>0.05)。脂蛋白脂酶激活实验:apoA-Ⅴ缺失突变体对LPL的激活作用都不同程度地降低。其中,A-Ⅴ(△(1-51))、A-Ⅴ(△(51-128))、A-Ⅴ(△(246-299))和A-Ⅴ(△(301-343))突变体在40pmol时LPL激活作用约为apoA-Ⅴ的2/3,A-Ⅴ(△(132-188))突变体激活作用约为apoA-Ⅴ的1/3,而突变体A-Ⅴ(△(192-238))和A-Ⅴ(△(56-227))几乎没有LPL激活作用。初步推断载脂蛋白A-Ⅴ激活LPL的活性结构域介于第192至第227这一较短的片段。结论:1.ApoA-Ⅴ属于α螺旋含量较高的蛋白,而且不同溶液环境下,二级结构会有一定程度的变化。相对于apoA-Ⅰ,apoA-Ⅴ维持着更为松散的结构。2.ApoA-Ⅴ蛋白不同部位对其脂质结合能力的影响差别很大;多肽链靠近氨基端区域主要维持apoA-Ⅴ的低可塑性;多肽链中央区域和羧基末端在介导apoA-Ⅴ与脂质结合过程中发挥重要作用,与apoA-Ⅰ相似。3.ApoA-Ⅴ不同片段对LPL激活作用有明显不同。多肽链中央区域对LPL激活作用至关重要,第192—227位氨基酸之间的片段,可能是激活LPL的关键结构域。第二部分小鼠脂质营养不良相关蛋白lipin1的功能研究脂质营养不良和肥胖正好是脂肪代谢的两个极端,而且可以归因于一些功能分类不同的基因表达的改变。研究已经表明,lipin1突变导致脂肪细胞分化障碍和小鼠脂质营养不良。通过组织特异性的脂肪细胞和骨骼肌细胞过表达动物模型,证明其可以促进肥胖。但机制不同,在脂肪细胞,影响脂肪贮存能力;而在骨骼肌细胞则决定整体能量消耗和脂肪利用。因此,单是lipin1水平的变化就可以引起脂肪代谢的极端状态,也反应了脂肪组织和骨骼肌调控脂肪多少和能量平衡的一种机制。我们的初步实验结果如下:(一)、完整小鼠lipin1蛋白在大肠杆菌中不表达,可能跟含有串联稀有密码有关;氨基端肽段原核表达为包涵体形式,制备出的兔抗小鼠多克隆抗体,与重组蛋白可以反应。(二)、荧光定位实验证实小鼠lipin1蛋白主要定位于细胞核内,而Gly84Arg突变确实导致定位改变,主要分布于胞浆,而Cys30Arg可以抑制这一突变体的作用。(三)、伴随绿色荧光蛋白的RNAi实验表明,像酵母细胞同源蛋白SMP2一样,lipin1可能与哺乳动物细胞的核被膜、内质网结构有关系,因为干扰lipin1表达后,绿色荧光蛋白在胞浆内呈斑点状分布。但需要进一步实验验证。(四)、建立的3T3-L1细胞分化模型为进一步研究lipin1的功能奠定基础。综上所述,我们克隆了小鼠lipin1全长编码区,并制备了多克隆抗体;对lipin1的核定位问题进行了初步研究;并对lipin1表达被干扰后细胞结构变化变化进行了简单探讨。
第一部分 人载脂蛋白A-Ⅴ(apoA-Ⅴ)及其缺失突变体的结构与功能研究第5-85页
    中文摘要第5-8页
    英文摘要第8-11页
    前言第11-15页
    实验路线第15-16页
    材料和方法第16-43页
        一、人载脂蛋白A-Ⅴ及其缺失突变体的原核表达、纯化与鉴定第16-36页
            (一)、实验材料第16-21页
            (二)、方法第21-36页
        二、重组人载脂蛋白A-Ⅴ及其缺失突变体结构与功能研究第36-43页
            (一)、试剂、仪器及耗材第36页
            (二)、方法第36-43页
    结果第43-63页
        一、人ApoA-Ⅴ及其缺失突变体原核表达质粒的构建、蛋白表达、纯化和鉴定第43-52页
        二、原核表达的野生型apoA-V及其缺失突变体结构和功能研究第52-63页
    讨论第63-69页
    小结第69-70页
    参考文献第70-75页
    文献综述第75-85页
第二部分 小鼠脂质营养不良相关蛋白lipin1的功能研究第85-104页
    中文摘要第85-86页
    英文摘要第86-87页
    前言第87-89页
    材料与方法第89-95页
    实验结果第95-101页
    讨论第101-104页
    小结第104页
参考文献第104-106页
综述第106-113页
附录第113-119页
    一、实验详图第113-115页
    二、英文缩写第115-117页
    三、试剂配方第117-119页
致谢第119页
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