蝙蝠蛾拟青霉菌丝体抗疲劳与耐缺氧作用及其机制研究

冬虫夏草为我国一种传统药材，自古以来就被作为滋补类中药而被广泛运用。改革开放后，随着我国医药研究的快速发展，冬虫夏草及其人工发酵培育替代品的功能也逐渐被揭示，同时也受到世界范围内的广泛关注与研究。目前，国内外研究已经表明虫草及其提取物或人工替代品具有多种药理学活性，如抗疲劳、耐缺氧、改善免疫功能、抗肿瘤、降血糖等作用[1,2]。然而野生冬虫夏草种类繁多，已发现种类多达400多种[3]，各类虫草及其替代品性质千差万别，对于普通患者或正常消费者来说更不易鉴别。此外，由于天然虫草生长条件苛刻，自然资源枯竭，并且市场的需求过多，价格昂贵，天然虫草已成为濒危资源，对其保护与合理利用刻不容缓。因此，目前对于研究开发药效稳定的虫草替代物日趋重要，这也是解决上述问题的有效途径。本课题所研究的药物蝙蝠蛾拟青霉菌丝体（Paecilomyces hepiali mycelium：PHM）源于西藏野生冬虫夏草中提取分离的蝙蝠蛾拟青霉菌株，并利用人工发酵培育的方式，对其进行大规模生产、提纯，从而得到的大量蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。对其药效的研究不仅可以评价其作为虫草替代品的潜力，缓解野生虫草的市场需求，同时也有利于保护濒危的野生冬虫夏草资源，并为其作为治疗药物的研发提供一定的理论基础和实验依据。疲劳是一种较为普遍的生理现象，其包括躯体疲劳及精神的疲劳。疲劳不仅严重影响我们的工作效率，运动能力，同时还影响到我们的家庭生活，甚至社会关系[4]。疲劳不仅伴随着各种疾病的发生如HIV、肝炎及肿瘤等[5,6]，而且也会导致机体免疫力下降，内分泌失调，从而引起各种疾病，如感染、糖尿病等[7,8]。本研究主要对PHM的抗疲劳与耐缺氧作用进行了评价，并且对其机制进行简单的探讨。研究目的：本课题主要研究人工发酵培育的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体（PHM）抗慢性疲劳（Chronic fatigue: CF）作用、预防性抗疲劳作用、耐缺氧作用及其潜在的作用机制，为研发高效稳定的野生冬虫夏草替代品提供一定的理论基础和实验依据。研究方法：第一部分实验：PHM对小鼠慢性疲劳的影响将72只雄性昆明小鼠随机分为6组，包括1个正常饲养组（Home）及5个CF组，6组小鼠分别灌胃（i.g.）给予溶媒、溶媒、13mg/kg莫达非尼、140mg/kgPHM、280mg/kg PHM以及560mg/kg PHM。Home组小鼠不进行攀跑训练，CF组小鼠在18天的训练中，每天于给药后40min通过小鼠轮式疲劳仪强迫小鼠进行攀跑训练30分钟。第一天的速度设为10.2m/min，并分别在第5、9、13、17天将速度逐渐增加至10.8m/min、11.4m/min、12m/min以及12.6m/min。第19天进行力竭训练，速度保持12.6m/min，并将攀跑时间延长至1h。在训练过程中如果小鼠攀跑速度下降或停止攀跑，其将滑落至通道的底端并受到1.2mA的电流电击[9]，以此来强迫小鼠完成训练任务。记录每次训练过程中每只小鼠受到电击的次数，并以此来评价小鼠疲劳程度。小鼠遭受的电击次数越多，则说明其躯体疲劳程度越严重。在第19天力竭疲劳训练结束后，将小鼠置于安静环境中休息40min。通过眼眶取全血样本于2mL塑料离心管中，45度斜面静置30min，4000×g离心15min，取上清存于-20℃冰箱备用。颈椎脱断处死小鼠后立即取新鲜后腿肌肉及肝脏组织样本，用冰冷生理盐水冲洗后，再用滤纸吸干，称重，存于-20℃冰箱备用。应用试剂盒检测小鼠的肌糖原（MG），肝糖原（LG），血清尿素氮（SUN），血清乳酸（SLA）和血清肌酸激酶（CK）水平。第二部分实验：PHM预防性抗疲劳作用按照同样方法将72只雄性昆明小鼠随机分为6组。除莫达非尼组每天给药一次外，其余各组每天灌胃给予两次PHM或溶媒，剂量与第一部分实验相同，连续给药14天。在给予14天的药物后，除Home组外，其他5组于给药后40min，8h，24h，48h进行30min的攀跑训练，并且在给药后第72h进行60min的力竭攀跑训练。攀跑速度设为12.6m/min，电流仍为1.2mA，记录每次训练过程中每只小鼠受到电击的次数。力竭训练结束后，将小鼠置于安静环境中休息40min。通过眼球摘除取血，血液样本分为两份，其中一份加入肝素制备为抗凝全血，存于4℃冰箱，用于检测血红蛋白含量（Hb）和全血ATP水平。另一份为未抗凝的全血，按照第一部分实验的方法处理后用于检测血清尿素氮（SUN）、血清乳酸（SLA）、血清肌酸激酶（CK）水平。另外，按照第一部分相同方法取小鼠的肝脏和肌肉组织，检测小鼠的肝糖元（LG）、肌糖元（MG）水平。第三部分实验：PHM耐缺氧作用将48只昆明小鼠随机分为4组，分别给予溶媒及140、280、560mg/kg的PHM。每天给药两次，连续给药十四天，给药时间分别为上午8:00和下午7:00。在末次给药40min后，将其放于盛有15g钠石灰的250mL广口瓶中，立即用涂有白凡士林的橡胶塞盖紧瓶口，并开始计时。计时开始后，再在瓶口与橡胶塞交接处迅速、均匀地加涂凡士林，以保证其密闭性。以呼吸停止为指标，记录小鼠的存活时间。按照相同给药及分组方式，另将48只小鼠在末次给药40min后分别腹腔注射400mg/kg的亚硝酸钠溶液，并立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠的存活时间。为了摒除主观计时影响，两次试验中，分组给药和计时由不同的实验人员完成。另将40只雄性昆明小鼠随机分为4组，按相同方式给药14天后，取全血，检测PHM对正常小鼠血红蛋白水平的影响。研究结果：1. PHM对小鼠慢性疲劳的影响：研究结果显示，Home组小鼠体质量虽然较Con组小鼠有所增加，但并无显著差异，此外给予PHM的小鼠体质量与Con组相比也未显示明显差异，说明PHM对CF小鼠的体质量并未造成显著的影响。在18天的训练过程中，与Con组相比，PHM在第17天的时显示出明显的降低小鼠电击次数的作用（Con:137.08±53.01versus PHM280and560mg/kg:93.67±40.45and79.00±33.48）。在第19天的力竭疲劳训练中，PHM中、高剂量也能够明显减少小鼠受到电击的次数（Con:240.08±88.80versus PHM280and560mg/kg:133.17±55.07and115.08±40.81）。阳性对照药物莫达非尼第1天（Con:105.00±59.19versus modafinil13mg/kg:51.75±26.49）给药后便能显著降低小鼠受到的电击次数，并且其作用一直持续到第19天（Con:240.08±88.80versus modafinil13mg/kg:85.17±45.04）也未出现耐受现象。与正常饲养组（MG:1.52±0.38; LG:54.13±9.58; SUN:5.54±1.51; CK:0.61±0.24）相比，Con组小鼠的MG与LG水平（MG:0.91±0.26; LG:22.24±2.92）明显降低，而SUN和CK水平（SUN:7.50±2.09; CK:0.85±0.27）明显升高。该结果显示Con组小鼠体内供能物质含量降低，致疲劳代谢产物增加。然而，在同等条件下，PHM却能逆转上述生化指标的异常状况，甚至恢复至正常水平。其中与Con组相比，PHM560mg/kg能够显著增加MG和LG（MG:1.28±0.24;LG:40.86±10.19）水平，并明显降低SUN，SLA及CK（SUN:5.77±1.31; SLA:5.67±1.66; CK:0.61±0.19）水平；PHM280mg/kg能显著降低SLA和CK含量SLA:5.56±1.99; CK:0.62±0.34）；PHM140mg/kg能显著增加MG与LGMG:1.19±0.29; LG:32.84±9.5）水平。莫达非尼虽然在行为学中能够快速显著地降低小鼠受到电击的次数，但其不能逆转小鼠疲劳相关的生化指标。2. PHM预防性抗疲劳作用：各组小鼠经过14天给予PHM或溶媒后，其体质量的增加并无显著差异，其结果与第一部分实验相似，由此说明PHM并不对小鼠的体质量造成显著的影响。与对照组相比，给予PHM的小鼠在停药后各次训练中，其电击次数明显降低。并且在停药后40min（Con:209.82±20.65versus PHM280and560mg/kg:122.91±21.61and135.33±22.18）、8h（Con:247.00±35.02versus PHM560mg/kg:159.18±22.64）、48h（Con:172.83±25.77versus PHM560mg/kg:96.00±18.00）以及停药后第72（hCon:296.18±37.36versus PHM140,280and560mg/kg:206.20±26.72,203.73±29.98and171.73±27.61）的力竭训练中都显示出了显著降低电击次数的作用。阳性对照药物莫达非尼在停药后40min（Con:209.82±20.65versus modafinil13mg/kg：122.18±104.97）和8h（Con:247.00±35.02versus modafinil13mg/kg：149.67±93.07）能够显著降低小鼠的电击次数，但在第24h后，其作用消失。生化指标结果显示与溶媒组Con组相比，PHM280和560mg/kg能够显著增加小鼠MG（Con:1.26±0.06versus PHM280and560:1.49±0.10and1.48±0.07）和LG（Con:18.72±1.59versus PHM280and560:26.85±2.06and28.01±2.04）的水平；并且还能够显著降低SLA（Con:9.13±0.4versus PHM280and560:7.5±0.32and7.38±0.34）以及CK（Con:0.87±0.06versus PHM280and560:0.69±0.06and0.66±0.56）的含量。PHM140mg/kg能够显著降低小鼠血清SLA（PHM140:7.45±0.33）水平；PHM280mg/kg能够显著降低小鼠血清SUN（PHM280:5.70±0.30)的水平；此外，PHM560mg/kg还能显著增加小鼠全血ATP（Con:3.65±0.50versus PHM560:5.17±0.46）水平。3. PHM耐缺氧作用：在小鼠常压缺氧存活实验（Con:23.63±2.01versus PHM140mg/kg:27.29±1.76; PHM280mg/kg:28.64±2.11; PHM560mg/kg:29.51±2.34）和亚硝酸钠中毒缺氧试验（Con:7.99±0.67versus PHM140mg/kg:9.89±1.09; PHM280mg/kg:10.40±0.58; PHM560mg/kg:10.28±0.82）中，通过在两周内每天给予小鼠两次不同剂量的PHM，小鼠的缺氧存活时间显著增加。在两次实验中，与Con组相比，PHM低、中、高剂量组均能显著增加小鼠缺氧存活时间。然而，PHM不同剂量给药两周后（每天两次），并没有对小鼠的血红蛋白水平造成显著的影响。结论：在本次研究中，PHM具有显著的抗疲劳以及耐缺氧作用。而通过疲劳、缺氧密切相关的生化指标检测提示了PHM可能通过增加能源物质储备，减少致疲劳代谢产物的累积而起到抗疲劳作用。而其耐缺氧及其它的抗疲劳机制是否与冬虫夏草相似，通过减少超氧自由基的积累，并增强机体清除自由基的能力而起作用，还需要进一步验证。其在抗疲劳、耐缺氧领域作为野生冬虫夏草的替代品可能具有良好的前景和较大的药物研发价值。