酵母培养物对瘤胃发酵影响及16S rRNA定量分析技术的应用研究

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本研究选择4头体重500~600kg安装有永久性瘤胃瘘管的阉牛,采用4×4拉丁方设计,在精粗比为55:45的日粮基础上分别补饲3种酵母培养物(YC),CT为对照组、DFM处理组补饲200g/d的DFM2、YS处理组补饲20g/d的Yea-sacc1026、XP处理组补饲100g/d的益康XP。试验期间采集瘤胃液和瘤胃内容物样品,分析饲喂周期内瘤胃pH值、NH3-N浓度、挥发性脂肪酸浓度的动态变化规律;测定内容物中羧甲基纤维素酶、水杨苷酶、木聚糖酶和微晶纤维素酶等4种纤维分解相关酶的活性;测定瘤胃中细菌总数,并合成了放射性标记的3种纤维分解菌(黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸拟杆菌)的16S rRNA种特异性寡核苷酸探针和1种细菌通用探针,与从瘤胃内容物中分离出的RNA样品进行定量狭线印迹杂交,测定这3种纤维分解菌的相对含量。综合研究酵母培养物对瘤胃发酵的影响和发挥作用的方式,探讨以16S rRNA定量杂交分析法测定瘤胃特定功能细菌相对数量的可行性和准确性。 研究结果表明:(1)添加YC对肉牛瘤胃pH值影响不显著(p>0.05),但能提高饲喂后2hr的NH3--N浓度(p<0.05);(2)YS处理的乙、丙、丁酸和总挥发性脂肪酸在一个饲喂周期内的平均浓度比对照组有显著提高(p<0.05),DFM和XP处理组也有提高这些指标的趋势,但差异不显著;同时DFM和XP组的乙酸/丙酸比例有显著降低(p<0.01),XP组也有降低的趋势,但差异不显著;(2)显著提高瘤胃内羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶的活性(p<0.01),但是不影响微晶纤维素酶活(p=02363);(3)补饲YC增加了瘤胃总细菌数(p=0.0724),显著提高了3种瘤胃纤维分解菌(黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸拟杆菌)总数和黄化瘤胃球菌数量在瘤胃细菌中的相对比例(p<0.01),但对白色瘤胃球菌(p=0.5432)和产琥珀酸拟杆菌(p=0.4177)在瘤胃细菌中的相对数量没有显著影响;(4)16S rRNA分析法测定结果表明3种纤维分解菌在瘤胃细菌中所占比例为3.80±0.2%。 综合分析上述结果,发现YC有提高瘤胃内羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶活性的效果,但不改变 代表纤维降解总效应的微晶纤维素酶活性,从酶学角度解释了YC能提高纤维的瘤胃降解起始速率而不改变总体降解率的现象;16s rRNA定量杂交分析法测定所得的结果与相关报道中采用最大似然数法和厌氧滚管法测定所得的结果相符,表明了该方法应用的可行性。
文献综述第9-20页
    引言第9-11页
    1. 细菌分类学中的新指标第11页
    2. 16S rRNA/rDNA基因序列分析在瘤胃细菌分类中的应用第11-12页
    3. 瘤胃细菌16S rRNA/rDNA序列分析技术第12-17页
        3.1 核酸分子序列的获得第12-14页
            3.1.1 菌体细胞裂解第12-13页
            3.1.2 16S rRNA分子直接抽提第13页
            3.1.3 定量PCR扩增16S rDNA序列第13-14页
        3.2 16S rRNA/rDNA碱基序列分析方法第14-17页
            3.2.1 核酸序列测定第14页
            3.2.2 遗传指纹技术第14-15页
            3.2.3 RNA印迹杂交分析第15页
            3.2.4 荧光原位杂交技术第15-16页
            3.2.5 DNA芯片技术第16-17页
        3.3 核糖体核酸序列数据库第17页
    4. 展望第17-20页
试验研究第20-52页
    1. 前言第20-21页
    2. 材料与方法第21-26页
        2.1 实验动物与饲养管理第21页
        2.2 添加剂种类与饲喂方法第21页
        2.3 试剂与溶液第21-22页
        2.4 试验设计及统计分析第22页
        2.5 样品采集和处理第22-23页
        2.6 分析测定方法第23-26页
            2.6.1 挥发性脂肪酸(VFA)的测定第23页
            2.6.2 NH3-N浓度测定第23页
            2.6.3 总菌数测定第23页
            2.6.4 三种纤维分解菌数量测定第23-25页
            2.6.5 酶活力测定第25-26页
    3. 结果第26-52页
        3.1 饲喂不同酵母培养物后瘤胃发酵的动态变化规律第26-33页
            3.1.1 瘤胃pH值第26-27页
            3.1.2 瘤胃NH_3-N浓度第27-29页
            3.1.3 瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)浓度第29-33页
        3.2 瘤胃纤维降解相关酶的活性第33-40页
            3.2.1 不同处理组的羧甲基纤维素酶活性第33-35页
            3.2.2 不同处理组的水杨苷酶括性第35-37页
            3.2.3 不同处理组的木聚糖酶活性第37-38页
            3.2.4 不同处理组的微晶纤维素酶活性第38-40页
        3.3 瘤胃细菌的数量第40-52页
            3.3.1 探针的设计和配比结果第40-44页
            3.3.2 不同处理对瘤胃细菌总数的影响第44-45页
            3.3.3 不同处理对黄化瘤胃球菌的影响第45-47页
            3.3.4 不同处理对白色瘤胃球菌的影响第47-49页
            3.3.5 不同处理对产琥珀酸拟杆菌的影响第49-50页
            3.3.6 不同处理对3种纤维分解菌总数量的影响第50-52页
4. 讨论第52-56页
    4.1 不同处理对瘤胃发酵的影响第52-53页
    4.2 不同处理对瘤胃细菌的影响第53-54页
    4.3 不同处理对瘤胃纤维分解相关酶活性的影响第54-55页
    4.4 16SrRNA种特异性寡核苷酸探针的选择第55-56页
    4.5 探针杂交法用于瘤胃细菌定量研究的可行性第56页
5. 结论第56-58页
    5.1 YC对瘤胃发酵的调控作用第56页
    5.2 YC对瘤胃细菌数量的影响第56-57页
    5.3 YC对瘤胃纤维分解相关酶活性的影响第57页
    5.4 饲料纤维的瘤胃降解机理第57页
    5.5 不同YC产品的作用效果第57页
    5.6 探针定量杂交法分析瘤胃细菌的应用前景第57-58页
参考文献第58-64页
致谢第64页
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