油菜受菌核菌侵染时,菌丝必须首先要穿过渗透油菜的细胞壁,所以要分泌一系列降解细胞壁的水解酶。菌核菌分泌的第一个酶就是多聚半乳糖醛酸酶(PG),它会降解油菜细胞壁的主要成分果胶,所以PG是菌核菌重要的致病物质。而多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)可以与PG特异性结合,从而阻止油菜细胞壁的降解,所以对PGIP的研究是十分有意义的。1、本文从菌核菌侵染油菜的机理入手,根据抗菌核病甘蓝型油菜湘油15在接种菌核菌18h后会诱导pgip2基因表达增加,所以提取接种菌核菌18h湘油15的叶片的总RNA,根据甘蓝型油菜pgip2(登录号为EU142024)设计一对特异性引物,以cDNA为模板,RT-PCR扩增其CDS编码序列,应运生物学信息软件对湘油15pgip2核苷酸、氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。发现其CDS序列与NCBI库(EU142024)公布的序列同源性为99.7%,其氨基酸序列与NCBI库公布的序列同源性为99.4%。发现湘油15 pgip2编码区CDS长996bp, PGIP2蛋白含331个氨基酸编码的ORF,分子量为37.1KDa,等电点为8.6。预测N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强。具有5个N-糖基化位点,N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基。对其疏水性预测,发现PGIP2是一典型的疏水蛋白。其二、三级结构显示湘油15PGIP2有11个α-螺旋,12个p-延伸链,24个无规则卷曲,蛋白质凹面结构主要由β-折叠/β-转角区构成,凸面结构主要是α-螺旋。中心LRR结构域由5个串联的亮氨酸重复结构域(1 eucine-rich repeat, LRR)基序组成,是由β折叠和a螺旋通过1oop环连接,形成一个马蹄型分子。从第121个氨基酸出现且具有"xLxxLDLSxNxLTGxIPxxLxxL"序列的共同序列,是与PG结合反应的区域。这将为PGIP2蛋白的生物学功能研究提供一定的理论依据。2、将克隆的pgip2 CDS基因亚克隆到原核表达载体pET-32a (+),成功的构建了重组质粒pET-32a-pgip2。该重组质粒以pET-32a系统的起始密码子开始,包括pET-32a载体N端Trx、6×His-Tag、S-Tag和Pgip2基因的序列,C端以Pgip2基因的终止密码子终止。重组质粒转化E.coli BL21(DE3), IPTG终浓度为分别为0.5mmol/L,0.2mmol/L,温度为37℃、25℃,对其重组质粒分别诱导2h,4h,6h,8h,通过SDS-PAGE检测,在预期分子量52KDa处出现表达条带。对其进行可溶性检测,所表达的蛋白都是以包涵体的形式存在,没有可溶形式蛋白的表达。此结论为以后研究植物的Pgip基因在大肠杆菌中的原核表达提供了宝贵的参考依据。3、采用超声波破碎方法裂解包涵体pET-32a-pgip2细胞,通过低浓度变性剂的洗涤液2mol/LUrea、0.5%TritonX-100、1mmol/LEDTA进行洗涤,得到纯度较高的包涵体。再用高浓度的变性剂8mol/LUrea溶解包涵体。通过Ni2+-NTA树脂进行纯化,融合蛋白N端含6×His-Tag会结合在Ni2+柱上,经过不同浓度的咪唑洗脱,最后得到纯度较高的pET-32a-pgip2融合蛋白。纯化后的目的蛋白经Western bolt检测,结果显示,pET-32a-pgip2融合蛋白均可以与抗-His抗体发生免疫学反应,约52KDa处出现一条特异性的反应条带,更进一步的地说明pET-32a-pgip2融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确地表达,且读码框正确。纯化的融合蛋白经过肠激酶酶切,再次经过Ni2+-NTA纯化,收集流出液得到PGIP2目的蛋白。最后通过逐渐降低透析液中尿素浓度的透析复性法对目的蛋白进行复性,得到有生物活性的PGIP2蛋白。4、通过对离体油菜叶片滴加PGIP2蛋白,再接种菌核菌菌丝来证明PGIP2蛋白可抑制菌核菌对油菜的侵染,实验显示在不同的天数里,滴加了PGIP2蛋白的叶片比对照滴加了灭菌水、PBS缓冲液的叶片,产生的病斑面积要小,且对油菜的侵害程度也轻,证明PGIP2蛋白对菌核菌侵染油菜有一定的抗性。DNS法测定PGIP2蛋白对PG的抑制作用,数据表明,随着PGIP2蛋白量的增加,PG降解多聚半乳糖醛酸生成D-半乳糖醛酸的量逐渐减少,充分证明PGIP2蛋白对PG有一定的抑制作用。琼脂糖扩散法测定PGIP2蛋白对PG的抑制作用,实验结果发现,随着PGIP2蛋白量在一定量PG里的增加,以多聚半乳糖醛酸作为底物的平板上,圆孔周围透明圈的面积逐渐变小,证明PGIP2蛋白对菌核菌产生的PG有较强的抑制作用,更进一步说明了,大肠杆菌中融合表达的PGIP2蛋白包涵体经过纯化、酶切、复性后是具有生物活性的。5、将克隆的pgip2基因,再次插入到带有CaMV35S强启动子和NOS终止子的植物表达载体pRI101-AN中,构建pRI101-pgip2超表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜98c40中,经Kan抗性筛选,获得约300株左右的抗性苗。以CaMV35S启动子特异性引物,对其进行PCR检测,有34株扩增出422bp的目的条带,说明成功获得了转pgip2基因油菜。对其中4株进行半定量RT-PCR检测,发现其中有2株与非转基因植株对比,Pgip2基因表达量上调,并且对这两株油菜的离体叶片接种菌核菌菌丝进行抗性鉴定,发现转基因和非转基因油菜叶片相比,病斑面积明显比较小,受害程度也轻微。结果表明,将Pgip2基因转入了98c40体内并且能够成功的超表达,并且与非转基因对比有效的提高了抗菌核病能力。
