C.sakazakii类胡萝卜素结构分析及其合成途径研究

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）能够合成类胡萝卜素。类胡萝卜素能够提高C. sakazakii对干燥和酸性环境的耐受性，与其致病能力密切相关。但是，C. sakazakii类胡萝卜素的组成、结构及其生物合成途径尚不清楚。本课题以C. sakazakii BAA-894为研究对象，针对其类胡萝卜素成分和生物合成途径中的关键基因展开工作。主要研究结论如下：（1）实验确定了C. sakazakii BAA-894合成类胡萝卜素的主要成分。自C. sakazakiiBAA-894中提取、分离、纯化类胡萝卜素，通过薄层色谱、紫外可见光扫描、离子色谱和液相色谱-质谱联用等分析手段，确定了C. sakazakii BAA-894合成的类胡萝卜素主要为单糖玉米黄素和双糖玉米黄素。（2）实验确定了C. sakazakii BAA-894类胡萝卜素合成基因簇crtE-idi-XYIBZ。通过Blast序列同源比对，在C. sakazakii BAA-894基因组DNA中发现了一个与类胡萝卜素合成相关的基因簇crtE-idi-XYIBZ。这个基因簇中的七个ORF与类胡萝卜素合成基因crtE、idi、crtX、crtY、crtB、crtI和crtZ具有很高的同源性。将基因簇crtE-idi-XYIBZ在Escherichia coli DH5α中异源表达，发现重组菌E. coli DH5α/pWSK29-EiZYIBX也能合成类胡萝卜素，通过提取、纯化和结构分析，确定其合成的类胡萝卜素是单糖玉米黄素和双糖玉米黄素。这说明基因簇crtE-idi-XYIBZ在C. sakazakii BAA-894中起到合成类胡萝卜素的作用。（3）实验确定了C. sakazakii BAA-894类胡萝卜素合成基因簇中关键基因的作用。将基因簇crtE-idi-XYIBZ中的关键基因在E. coli DH5α中串联表达，构建了六种重组菌：DH5α/pWSK29-i、 DH5α/pWSK29-Ei、 DH5α/pWSK29-EiB、 DH5α/pWSK29-EiIB、DH5α/pWSK29-EiYIB和DH5α/pWSK29-EiZYIB。通过提取、纯化和结构分析，发现DH5α/pWSK29-EiIB能够合成番茄红素，DH5α/pWSK29-EiYIB能够合成β-胡萝卜素，DH5α/pWSK29-EiZYIB能够合成隐黄质和玉米黄素。这进一步确定了基因簇crtE-idi-XYIBZ中关键基因在C. sakazakii BAA-894类胡萝卜素合成中所起的作用。（4）实验证实了idi对于C. sakazakii BAA-894类胡萝卜素合成的促进作用。C.sakazakii类胡萝卜素合成基因簇crtE-idi-XYIBZ与普遍存在的基因簇crtEXYIBZ相比多了异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因idi，为了研究idi对类胡萝卜素合成的影响，构建了重组菌C. sakazakii BAA-894/pWSK29-i和E. coli DH5α/pWSK29-EIB。通过提取、纯化和定量分析，发现BAA-894/pWSK29-i类胡萝卜素合成量比BAA-894/pWSK29提高了80%，E. coli DH5α/pWSK29-EiIB类胡萝卜素合成量也比DH5α/pWSK29-EIB提高了60%。这说明C. sakazakii类胡萝卜素合成基因簇中的idi能够提高类胡萝卜素的合成量。