基于质谱核磁共振的IgA肾病患者血清中代谢组学研究

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目的:应用质谱核磁共振(1H-NMR)代谢组技术,研究不同病程IgAN患者和健康者血清中代谢物,筛选不同病程IgAN的特征代谢物,建立IgAN患者血清代谢图谱的诊断模型,并从代谢途径探讨IgAN发病机制,为IgAN早期监测、诊断及发病机制提供新的思路。方法:收集2010年8月至2011年1月在广西桂林第一八一医院肾脏科就诊的患者临床资料。实验组35例由肾活检和临床生化结果确诊为原发性IgAN患者,未使用激素和免疫抑制剂强化治疗,且排除系统性红斑狼疮、过敏性紫癜、慢性肝病、恶性肿瘤、糖尿病等疾病。根据Lee氏分级标准将IgAN病理分为Ⅰ~Ⅴ级,23例Ⅰ~Ⅲ级为低危组,用IgAN-A表示;12例Ⅳ~Ⅴ级为高危组,用IgAN-B表示。对照组为23例体检正常的健康志愿者,用C表示。利用Varian INOVA600谱仪检测两组IgAN患者组和健康组血清标本,采集NMR谱图后进行数据预处理,采用主成分分析(PCA)对NMR数据代谢信息进行总体分析,然后利用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对不同组样本进行分类预测,并用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对模型质量进行10折交叉验证。利用统计学方法分析相关系数的显著性差异,鉴定不同病程的IgAN患者和健康者血清中差异性代谢成分,并验证代谢诊断模型的灵敏性、特异性和分辨率。最后,根据差异性代谢物信息构建与IgAN相关的代谢途径网络,从代谢层面揭示IgAN病程发病机制。结果:1.生化结果显示:健康组血总蛋白、白蛋白和球蛋白水平明显高于IgAN组(P<0.05);健康组血尿素氮、肌酐和尿酸水平显著低于IgAN-A组(P<0.01)和IgAN-B患者(P<0.001);IgAN-B组24h蛋白尿定量显著高于IgAN-A组(P<0.01)。2.IgAN组病理免疫分型结果为:单纯IgA型12例(34.29%),IgAG型5例(14.28%),IgAM型6例(17.14%),IgAGM型3例(8.57%),IgAMC3型4例(11.42%),IgAGMC4型2例(5.71%),IgAGC1q3例(8.57%)。IgAN-A组IgA、IgM、补体C3沉积强度明显小于IgAN-B组(P<0.05),其他IgG、IgM、补体C4、C1q沉积强度差异无统计学意义(P>0.05)3.1H-NMR代谢组学检测的结果为:得到了IgAN-A组、IgAN-B组和健康组血清典型的1H-NMR谱图;PCA得分图中IgAN组和健康组区分清楚,而IgAN-A组和IgAN-B组区分不明显;PLS-DA和OPLS-DA分析方法对不同组样本分类预测,可以区分出IgAN组和健康组(可解释指标R2>0.8,可预测指标Q2>0.5),但对IgAN-A组(?)(?)IgAN-B组预测能力低(R2=0.573,Q2=-0.160);模型预测灵敏性为88.6%,特异性为97.1%和分辨率为93.1%。4.与健康者相比,IgAN患者血清中代谢表型是:丙酮酸盐、苯丙氨酸、myo-肌醇、乳酸盐、不饱和脂类(如L5:Lipid-CH2-C=O; L6:Lipid,=CH-CH2-CH=; L3:Lipid,-CH2-CH2-C=O)、肌酸和肌酸肝含量显著增加,而α-葡萄糖、β-葡萄糖、缬氨酸、酪氨酸、磷酸胆碱、赖氨酸、异亮氨酸、甘油磷酸胆碱、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、醋酸盐、3-羟基丁酸、1-甲基组氨酸含量下降;低危组和高危组之间代谢物差异不明显(P>0.05)。5.24种潜在的IgAN生物标志物参与了糖类代谢、脂类代谢、蛋白质代谢和三羧酸循环和肌酸合成代谢。结论:1.1H-NMR代谢组技术结合PCA、PLS-DA和OPLS-DA模式识别方法是高通量筛选IgAN患者血清中代谢物差异表达的有效研究手段。2.使用PCA、PLS-DA和OPLS-DA对NMR谱数据进行模式识别分析,可以区分IgAN患者和健康者代谢物的差异,但是不能很好的区分病理程度不同的IgAN患者。3. PLS-DA和OPLS-DA模型验证有效性高,代谢物模式图能够反映患者肾脏的IgAN病理变化,优于临床的生化检测和组织病理学分析。4. IgAN患者体内的代谢表型发生了显著变异,24种特征代谢物有可能是IgAN早期诊断和预测的新的有效生物标记物。5. IgAN导致了糖类代谢、脂类代谢、蛋白质代谢和三羧酸循环和肌酸合成代谢系统紊乱,具体表现是糖酵解作用、脂类代谢和肌酸合成代谢增强,糖异生作用和蛋白质代谢减少,三羧酸循环紊乱,为人们从代谢物层面理解IgAN发病机制提供了一个崭新的视角。
中文摘要第3-5页
ABSTRACT第5-7页
1 前言第10-16页
    1.1 国内外研究IgAN发病机制的现状分析第10-12页
        1.1.1 与IgA结构异常有关第10-11页
        1.1.2 与T细胞和B细胞免疫调节异常有关第11页
        1.1.3 与骨髓异常有关第11页
        1.1.4 与细胞因子有关第11页
        1.1.5 与遗传因素有关第11-12页
        1.1.6 IgAN发病机制的研究趋势第12页
    1.2 ~1H-NMR代谢组学技术在临床研究中的应用第12-16页
        1.2.1 代谢组学和代谢组学技术的概述第12-14页
        1.2.2 ~1H-NMR代谢组学技术的临床应用第14-16页
2 材料与方法第16-23页
    2.1 材料第16-18页
        2.1.1 研究对象第16页
        2.1.2 实验主要试剂和仪器第16-18页
    2.2 方法第18-23页
        2.2.1 血清和尿标本收集第18页
        2.2.2 临床生化检测第18页
        2.2.3 肾组织病理学检查第18-19页
        2.2.4 核磁共振检测第19-20页
        2.2.5 模式识别分析第20-21页
        2.2.6 筛选差异性代谢物第21-22页
        2.2.7 构建代谢途径网络第22页
        2.2.8 统计分析方法第22-23页
3 结果与分析第23-35页
    3.1 临床资料第23-24页
    3.2 病理资料第24-25页
        3.2.1 病理类型分布第24页
        3.2.2 免疫病理特点第24-25页
    3.4 各组血清样品的~1H NMR图谱第25-27页
    3.5 模式识别分析第27-32页
        3.5.1 PCA第27-28页
        3.5.2 PLS-DA第28-30页
        3.5.3 OPLS-DA第30-32页
    3.6 差异代谢物的筛选第32-34页
    3.7 代谢途径的分析第34-35页
4 讨论第35-40页
    4.1 IgAN患者临床与病理相关性讨论第35页
    4.2 ~1H-NMR代谢组学技术应用于IgAN研究的讨论第35-36页
    4.3 从代谢途径探讨IgAN发病机制第36-38页
        4.3.1 IgAN患者体内能量代谢途径第36-37页
        4.3.2 IgAN患者体内脂类代谢途径第37-38页
        4.3.3 IgAN患者体内蛋白质代谢途径第38页
        4.3.4 IgAN患者肌酸合成代谢途径第38页
    4.4 ~1H-NMR代谢组学技术研究IgAN的临床意义第38-39页
    4.5 课题存在的问题讨论第39-40页
5 结论与展望第40-42页
    5.1 结论第40页
    5.2 展望第40-42页
参考文献第42-50页
英文名称缩略表第50-52页
攻读硕士学位期间发表的论文目录第52-53页
致谢第53-55页
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