目的:糖尿病（diabetes mellitus, DM）是病死率最高的前三位严重疾病之一,糖尿病人发生血管并发症（包括微血管病变和大血管病变）的风险比非糖尿病者高2-4倍。糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者发生的常见而难治的慢性微血管并发症,也是糖尿病致死、致残的重要原因。目前认为,DN的发生和发展是在遗传背景基础上,多因素综合作用的结果,包括肾组织糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、肾脏血流动力学异常等,其中氧化应激（oxidative stress, OS）已被认为是DN的重要发病机制之一。氧化应激是指机体或细胞内自由基产生与消除失衡,或外源性氧化物质的过量摄入,导致活性氧（reactive oxygen species, ROS）或活性氮（reactive nitrogen species,RNS）等产生过多,而引起的细胞毒过程。过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite, ONOO-）是RNS的重要成员之一。研究发现,糖尿病时诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）活性增高,导致NO的过量产生。过量的NO可与O2-快速反应生成ONOO-。ONOO-可作为强氧化剂或蛋白质硝化剂,造成许多重要的生物大分子结构修饰或功能障碍。其中蛋白质酪氨酸残基可被ONOO-硝化形成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine, 3-NT）,因此,NT常被作为体内ONOO-生成的生物标志物。近年的研究发现,ONOO-参与了动脉粥样硬化、急性肺损伤、败血症、休克、缺血再灌注损伤及帕金森症等多种疾病的发生发展。其中愈来愈多的研究证实,ONOO-在糖尿病及其并发症中发挥了重要的作用。但目前ONOO-与DN的关系鲜有报道,对ONOO-致DN发病的具体机制更是知之甚少。目前已知的ONOO-致病理损伤的机制主要涉及:抑制蛋白质活性、导致脂质过氧化、引起DNA裂解、干扰线粒体能量代谢及诱导真核细胞凋亡或死亡等。近年的研究表明,ONOO-在多种细胞信号转导途径中同样发挥重要的调控作用,如MAPK信号途径、PI3K/Akt信号途径、NFκB信号途径等。ONOO-通过激活或抑制信号转导,参与众多疾病的发生发展。最近,Platt DH等发现ONOO-在血管内皮细胞可通过激活STAT3增加VEGF的表达。值得注意的是,Janus kinase（JAK）/signal transducer and activators of transcription（STAT）信号途径的激活会促进肾小球系膜细胞（mesangial cell, MC）的生长及增生,导致TGF-β1及细胞外基质蛋白如纤连蛋白（fibronectin, FN）等分泌增加,从而参与DN的发生发展。JAK/STAT信号途径是否参与ONOO-介导的糖尿病肾损伤?尚未见报道。大量研究表明,TGF-β作为JAK/STAT信号途径重要的下游调控分子在DN中发挥着重要作用。TGF-β可以刺激MC产生细胞外基质（extracellular matrix,ECM）如胶原IV、层粘连蛋白及FN等,导致基底膜增厚、系膜区扩增及纤维化。此外,TGF-β还参与介导高糖环境下MC众多基本生物学行为,如增生、肥大及凋亡等。研究发现,TGF-β可诱导细胞周期负性调节蛋白（CKI）表达增高,从而抑制cyclin/CDK活性,阻碍细胞周期G1/S期的转化,导致细胞增生受抑。同时,Khera T等发现,TGF-β1可诱导MC凋亡。研究证实,MC的增殖和凋亡等生物学行为与DN密切相关。因此,鉴于TGF-β在糖尿病肾病ECM病变及介导MC生物学行为中发挥的重要作用,ONOO-激活JAK/STAT信号通路后是否通过诱导TGF-β,从而参与糖尿病肾损伤?目前尚未见相关报道。本实验应用糖尿病大鼠模型和体外培养的人肾小球系膜细胞（HMC）,从整体、细胞和分子三个水平,系统观察糖尿病肾病大鼠肾组织及高糖刺激下的HMC中ONOO-、JAK/STAT信号途径及其下游信号分子TGF-β1、FN的表达情况以及高糖对HMC增殖、凋亡的影响;同时应用ONOO-的特异性清除剂尿酸（uric acid,UA）和JAK2的特异性抑制剂AG490进行干预,观察相应指标的变化情况。以探讨ONOO-在DN损伤中的作用;JAK/STAT信号途径及其下游信号分子TGF-β1、FN是否参与了ONOO-介导的DN的病理损伤,旨在深入阐明ONOO-在DN中的作用及其具体机制,并为DN的药物开发提供新思路。方法:1动物模型的建立及血、尿生化指标测定Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组（DM组）和尿酸组（Urate组）。DM组大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素40mg/kg（STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.4）,对照组只注射等剂量枸橼酸盐缓冲液,Urate组按40mg/kg腹腔注射STZ,并用尿酸水溶液灌胃（160mg/kg/d）,同时对照组和DM组大鼠灌以等剂量水溶液。72h后测定空腹血糖和尿糖,空腹血糖值≥13mmol/L,尿糖值+++++++者确定为DM模型。糖尿病大鼠模型建成后13周,每组取5只大鼠称重,分别用代谢笼收集24h尿,用于测定尿蛋白（Upro）和尿肌酐（Ucr）;股动脉取血,分离血清,用于测定血糖（Glu）、尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）。2肾组织常规病理学观察、ONOO-, JAK/STAT信号途径及其下游信号分子TGF-β1, FN表达的检测糖尿病大鼠模型建成后13周,正常对照组、DM组和Urate组每组各取5只大鼠称重,切取肾脏,取部分肾组织置于4%多聚甲醛或2%戊二醛固定,用于光镜、透射电镜的常规病理学观察;免疫组织化学染色法检测NT总蛋白（ONOO-的标志物）的表达;取部分肾皮质组织提取总蛋白,Western blot检测NT总蛋白、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、TGF-β1及FN蛋白表达;取部分肾皮质组织提取总RNA,半定量RT-PCR检测TGF-β1mRNA和FN mRNA表达。3体外培养HMC中ONOO-、p-JAK2/p-STAT3、TGF-β1及FN蛋白表达的检测应用含10%胎牛血清及100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养基对HMC培养。体外培养HMC融合到70-80%后,用无血清RPMI1640培养基同步培养24h,之后将细胞分成5组:正常对照组（5.5mmol/L葡萄糖）;高糖组（30mmol/L葡萄糖）;甘露醇高渗对照组（5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）;高糖+AG490组（30mmol/L葡萄糖+10μmol/L AG490）;高糖+尿酸组（30mmol/L葡萄糖+100μmol/L尿酸）。分别在6孔板和25cm2塑料培养瓶内培养,培养12、24、48h倒置显微镜观察细胞形态学改变;培养12、24、48h分别收集细胞及其上清液、提取细胞总蛋白。采用免疫细胞化学和Western blot检测NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1蛋白的表达;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞上清液中TGF-β1及FN蛋白的含量。4体外培养HMC增殖和凋亡的检测将体外培养HMC按每孔200μL,密度4000/well接种于96孔板,待细胞贴壁24h后,吸去上清,加无血清RPMI 1640培养基200μL同步培养24h。之后将细胞分成4组:正常对照组、高糖组、甘露醇高渗对照组及高糖+尿酸组。采用MTT法检测不同时间点（12h、24h和48h）各组细胞的增殖状态。待25cm2的培养瓶中HMC融合到70-80%后,用无血清RPMI 1640培养基同步培养24h,之后将HMC分组（正常对照组、高糖组、甘露醇高渗对照组、高糖+AG490组及高糖+尿酸组）,48小时后,采用流式细胞术（FCM）检测各组HMC凋亡率以及细胞周期各期相百分比。结果:1糖尿病大鼠肾组织中ONOO-、JAK/STAT信号途径及其下游信号分子TGF-β1、FN的表达①肾脏病理形态学改变:光镜HE、PAS染色显示,与正常组相比,糖尿病组肾小球系膜区增宽,基质增生,部分肾小球毛细血管腔扩张,肾小球和肾小管的基底膜增厚,可见肾小球硬化。电镜观察,糖尿病组肾小球基底膜较正常组明显增厚,厚薄不均,系膜基质增多,足细胞足突广泛融合。②血尿生化指标的改变:与正常组比较,糖尿病组的内生肌酐清除率（creatinine clearance, Ccr）降低,血糖、血尿素氮、24小时尿蛋白显著升高。③免疫组化结果显示:正常组肾小球NT总蛋白呈弱阳性表达;糖尿病组与正常组相比阳性表达增强,主要定位于肾小球固有细胞的胞浆和胞核,肾小管表达少,呈棕黄色颗粒。④Western blot结果显示:与正常组相比,糖尿病组NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、TGF-β1和FN蛋白表达均明显升高,JAK2、STAT1、STAT3的表达正常组与糖尿病组无明显差异。⑤半定量RT-PCR结果显示:TGF-β1 mRNA和FN mRNA在正常组仅有少量基础表达,糖尿病组二者表达均明显升高。2尿酸对糖尿病大鼠肾组织ONOO-、JAK/STAT信号途径及其下游信号分子TGF-β1、FN表达的影响①肾脏病理形态学改变:尿酸能够显著改善糖尿病大鼠肾小球病变:系膜区面积减小,基底膜变薄,足突融合得到缓解。②血尿生化指标的改变:与糖尿病组相比,尿酸组Ccr升高,血尿素氮降低,24小时尿蛋白减少。③免疫组化及Western blot结果显示:尿酸能显著下调糖尿病组NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、TGF-β1和FN蛋白的高表达。④半定量RT-PCR结果显示:尿酸组TGF-β1 mRNA和FN mRNA的表达较糖尿病组显著下降。3高糖环境下HMC细胞中ONOO-、JAK/STAT信号途径及其下游信号分子TGF-β1、FN的表达以及高糖对HMC增殖和凋亡的影响①HMC形态学改变:随高糖刺激时间的延长,细胞逐渐变长,细胞突起减少,胞质内出现较多颗粒及空泡。②免疫细胞化学显示:对照组HMC中NT总蛋白未见明显阳性表达,p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1仅见少量基础表达;高糖组HMC中NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1表达显著增强。NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达以胞浆为主,伴少量胞核表达;TGF-β1阳性颗粒主要分布在细胞浆。③Western blot结果显示:对照组NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT3仅见少量基础表达,高糖组各蛋白表达较对照组均明显升高,并且随着时间的延长逐渐增多,其中以48h组表达最为显著。④ELISA检测显示:与对照组相比,高糖组自12h起TGF-β1及FN含量显著上升,并且随着时间的延长含量逐渐增多。⑤MTT法检测细胞增殖水平显示:12h及24h高糖组细胞增殖与正常对照组无明显差异,48h高糖组细胞增殖较对照组显著受抑,OD值分别为0.362±0.022和0.636±0.047。⑥FCM对细胞凋亡及细胞周期分布的检测显示:48h高糖组细胞凋亡率（11.53±2.16 %）较对照组（1.23±0.07 %）明显增高;细胞周期G0/G1期比例明显增多,S期、G2/M期比例明显减少。4尿酸对高糖环境下HMC细胞ONOO-、JAK/STAT信号途径、TGF-β1、FN表达的影响及其与HMC增殖和凋亡的关系①HMC形态学改变:高糖+尿酸组HMC形态接近正常对照组;与高糖组相比,细胞变短,突起增多,胞质内颗粒减少。②免疫细胞化学显示:高糖+尿酸组,NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1蛋白表达较高糖组均明显减弱。③Western blot结果显示:与同期高糖组相比,高糖+尿酸组NT总蛋白、p-JAK2、p-STAT3表达均明显下降。④ELISA检测显示:尿酸可以有效的减少高糖组各个时段（12h、24h、48h）细胞上清液中TGF-β1及FN的含量。⑤MTT法检测细胞增殖水平显示:48h高糖+尿酸组细胞增殖活性较48h高糖组增高,OD值分别为0.698±0.014和0.362±0.022。⑥FCM对细胞凋亡及细胞周期分布检测显示:48h高糖+尿酸组细胞凋亡率（4.61±0.39 %）较48h高糖组（11.53±2.16 %）减少;细胞周期G0/G1期比例减少,S期、G2/M期比例增多。5 AG490对高糖环境下HMC细胞ONOO-、JAK/STAT信号途径、TGF-β1、FN表达的影响①免疫细胞化学显示:高糖+AG490组,p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1蛋白表达较高糖组均明显减弱。②Western blot结果显示:与同期高糖组相比,高糖+AG490组p-JAK2、p-STAT3表达均明显下降;而NT总蛋白表达与同期高糖组差异无统计学意义。③ELISA检测显示:高糖+AG490组各个时段（12h、24h、48h）细胞上清液中TGF-β1和FN的含量较同期高糖组明显减少。④FCM对细胞凋亡的检测显示:48h高糖+AG490组细胞凋亡率（5.70±0.72 %）较48h高糖组（11.53±2.16 %）减少。结论:1 NT总蛋白（ONOO-的标志物）高表达可能与DN的发生发展相关,ONOO-的特异性清除剂—尿酸可能在防治DN中发挥重要作用。2 JAK/STAT信号通路的激活与DN的发生发展可能相关;尿酸对ONOO-的清除可能与JAK/STAT信号通路的激活受抑有某种相关性;ONOO-可能是作为JAK/STAT信号通路的上游信号分子参与DN的发生发展。3 TGF-β1及FN的过多生成可能是引发DN的机制之一;JAK/STAT信号通路的激活与TGF-β1及FN的过多生成可能相关;TGF-β1及FN的过多生成可能参与了ONOO-介导的糖尿病肾损伤。4 ONOO-可能参与介导了高糖对MC增殖、凋亡和细胞周期的影响。
