模拟缺氧条件下BRL-3A和IEC-6细胞中基因YY1功能的实验研究

【背景】基于目前重度失血性休克救治中靶向治疗手段的缺乏，以及创伤失血性休克相关基础研究与临床的脱节，急切需要我们重新审视已知对创伤失血性休克病理的认识。前期，我们在一种相对接近临床的肝左外叶切除+2.5ml/100g（体重）的大鼠创伤失血性休克模型上，摸索到24小时死亡率接近50%的干预条件，之后对存活和死亡大鼠失血前肝脏进行表达谱基因研究，筛查出约100个差异基因，随后对这些差异基因进行调控网络分析。数据表明有18个基因参与了这些差异基因的网络调控，进而，结合专业知识，我们筛选了18个基因中EPHX2、AOC3进行转录因子预测，转录因子YY1进入我们研究视野，通过体内实验，我们测定了YY1在失血性休克后的表达变化，数据表明失血性休克后大鼠肝脏中YY1表达下降，该发现为本研究提供了实验基础。转录因子YY1是动物界普遍存在的、保守的、多功能的调控因子，为一种锌指结构蛋白，在人类约近7～10%的基因有YY1转录结合位点。已知YY1高表达和多种肿瘤的发生、发展、浸润有关。不少学者认为YY1有可能成为肿瘤研究和治疗的新靶点。前期我们在动物体内试验中发现的失血性休克后YY1表达下降，其和失血性休克病理进程有无直接联系？本研究拟通过体外实验明确失血性休克病理中两个易累及重要脏器细胞—肝细胞和小肠粘膜上皮细胞（大鼠）在缺氧条件下细胞功能与YY1的关系。为失血性休克的治疗筛选新的靶点提供实验依据。【目的】观察缺氧条件下大鼠BRL-3A、IEC-6细胞中YY1表达及细胞凋亡，初步明确缺氧和YY1表达的联系；构建、使用YY1mRNA干扰载体，对YY1mRNA进行敲减，观察YY1基因敲减后细胞增殖和凋亡，明确在模拟缺氧条件下YY1表达改变和BRL-3A、IEC-6细胞功能的关系。【方法】1.在梯度浓度CoCl2模拟缺氧条件下，利用Western Blot和RT-PCR检测BRL-3A、IEC-6细胞YY1基因蛋白和mRNA表达变化，并为后续试验筛选合适的缺氧条件。2.设计、合成、筛选YY1基因有效干扰靶点，构建慢病毒包装表达载体pLenti6.3-EGFP-YY1-miR，并感染293T细胞以评价干扰效率，并确定最佳MOI。3.常氧和100μM CoCl2模拟缺氧条件下利用Western Blot、免疫荧光和RT-PCR检测已构建载体感染后BRL-3A、IEC-6细胞中转录因子YY1蛋白和mRNA表达。4.利用流式细胞仪和CCK-8法检测常氧和100μM CoCl2模拟缺氧条件下BRL-3A、IEC-6细胞在pLenti6.3-EGFP-YY1-miR慢病毒感染后增殖和凋亡。【结果】1.随CoCl2浓度增加，BRL-3A、IEC-6细胞培养24h小时、72小时后目的基因YY1蛋白和mRNA表达逐渐下调。CoCl2浓度为250μM时IEC-6细胞中YY1蛋白表达下调出现统计学差异表达，CoCl2浓度为500μM时BRL-3A细胞中YY1蛋白表达有统计学差异表达。2.针对基因YY1设计4个靶点，确定其中3个预测高效靶点，从中筛选一个有效靶点。成功构建YY1mRNA干扰载体pLenti6.3-EGFP-YY1-miR。3.常氧条件下pLenti6.3-EGFP-YY1-miR载体有效下调BRL-3A、IEC-6细胞中YY1蛋白和mRNA表达.4.在100μM CoCl2模拟缺氧条件下pLenti6.3-EGFP-YY1-miR载体感染后BRL-3A、IEC-6细胞中和mRNA表达较常氧状态下进一步下调。pLenti6.3-EGFP-YY1-miR载体干扰BRL-3A后YY1蛋白表达无差异，RNA干扰IEC-6后YY1蛋白表达上调。5.常氧条件下pLenti6.3-EGFP-YY1-miR载体转染加重BRL-3A细胞凋亡、增殖减慢；在IEC-6细胞中增殖减慢，凋亡无差异改变。6.100μM CoCl2模拟缺氧条件下pLenti6.3-EGFP-YY1-miR载体引起的BRL-3A、IEC-6细胞凋亡进一步加重、细胞增殖进一步减缓。【结论】1.体外实验证实CoCl2可引起BRL-3A和IEC-6细胞凋亡增加、YY1表达降低。常氧下YY1RNA干扰载体能对BRL-3A细胞YY1基因进行有效敲减，进而引起细胞凋亡增加、增殖减慢，抑制细胞功能。由此推论模拟缺氧引起BRL-3A细胞中YY1表达下调参与了细胞凋亡增加和增殖减缓进程。2.缺氧状态下YY1RNA干扰后目的基因表达无一定规律性。缺氧条件下RNA干扰技术实施结果存在不确定性。