猪睾丸细胞多次传代的CSFV E2基因遗传变异及E2蛋白在细胞中表达的研究

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猪瘟病毒(CSFV)E2基因是目前研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因,其所编码的gp55蛋白是CSFV的主要保护性抗原。采用猪睾丸细胞(ST)做为受体细胞,结合使用哺乳动物细胞表达载体来表达E2基因,首先可充分利用受体细胞遗传密码子的嗜好性提高重组蛋白的表达量,另外因ST来源于猪,其后加工与其他表达宿主相比具有优越性,其疫苗的免疫保护力和免疫原性有望得到进一步提高,为CSFV基因工程苗推广应用奠定基础。本研究包括三个试验内容,首先对CSFV福建地方流行株FJ1和FJ2株的E2基因进行了克隆与测序,分析与猪瘟(CSF)疫苗C株的同源性,初步了解福建地方分离株的变异情况。其次利用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)方法,对多次ST传代的和多次动物传代的CSF石门强毒株(Shimen株)E2基因的序列分别进行了测定,并与标准Shimen株E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性进行比较,旨在探讨CSFV在ST中多次传代后的遗传稳定性。最后利用ST作为受体细胞来表达CSFV的E2基因,为建立用重组蛋白作为抗原的CSFV检测方法和CSF基因工程疫苗的应用奠定基础。本研究试验与结果如下:1.使用PCR技术分别扩增2株CSF福建地方流行毒株的E2基因,并克隆于pMD-18T载体进行核苷酸测序,根据CSFV的Alfort株、Brescia株及C-株(疫苗毒)确定起始氨基酸三联体位置后进行氨基酸序列推导,同时进行同源性比较和E2蛋白结构分析。结果显示,FJ1和FJ2株的E2基因的长度均为1170 bp,编码的氨基酸序列长度均为384个氨基酸,包括完整的信号肽和部分跨膜序列。2毒株的E2基因核苷酸序列同源性为90.79%,氨基酸序列同源性为89.84%,其与C-株E2基因的核苷酸序列同源性为82.87%-82.96%,氨基酸序列同源性为87.76%-90.10%,结果表明,2008年福建部分地区CSF流行毒与C-株的E2蛋白之间存有一定差异,这为当前CSF防控奠定一定理论与物质基础。2.CSFV Shimen株经猪体多次传代和ST多次传代后,得到传代病毒P-Shimen和ST-Shimen。利用PCR技术分别扩增P-Shimen和ST-Shimen株E2基因,并进行核苷酸序列测定,比较分析P-Shimen株、ST-Shimen株及Shimen标准株的E2基因核苷酸和氨基酸序列同源性。结果发现,P-Shimen株和Shimen标准株核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸序列同源性为99.0%,ST-Shimen株和Shimen标准株的核苷酸序列同源性为98.3%,氨基酸同源性为96.7%,结果显示,ST-Shimen株E2基因较P-Shimen株的变异差异不明显,并与Shimen标准株保持较高的同源性,结果表明了CSFV在ST中能保持其遗传的相对稳定性,为ST作为CSF疫苗制备的工具细胞提供可能。3.克隆CSFV的E2基因至pEGFP-C1真核表达载体上,使用脂质体法将重组质粒转染入ST中,通过荧光观察和G418筛选出阳性细胞克隆。荧光观察和PCR检测表明E2基因已导入阳性细胞克隆;使用免疫组化试验表明表达的蛋白为CSFV的E2蛋白,这为以重组蛋白为抗原的CSFV检测方法的建立和CSF基因工程疫苗的应用奠定基础。
摘要第9-11页
Abstract第11-12页
第一章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展第13-29页
    1 猪瘟研究进展第13-17页
        1.1 猪瘟的流行与世界分布第13页
        1.2 猪瘟的临床症状第13-14页
        1.3 猪瘟的诊断第14-15页
        1.4 猪瘟病毒粒子结构、形态及理化特性第15-16页
        1.5 猪瘟病毒的侵入及其在宿主体内的分布第16页
        1.6 猪瘟病毒在宿主细胞中的繁殖过程第16-17页
    2 猪瘟病毒分子生物学研究进展第17-19页
        2.1 猪瘟病毒的基因组结构和全序列研究概述第17页
        2.2 猪瘟病毒的基因组结构第17-18页
        2.3 CSFV 基因组全序列研究进展第18-19页
    3 猪瘟病毒基因组编码的蛋白质及其功能第19-23页
        3.1 猪瘟病毒的结构蛋白及其功能第20-22页
        3.2 非结构蛋白及功能第22-23页
    4 猪瘟病毒分子免疫学研究进展第23-25页
    5 猪瘟的防制策略与防制新技术的研究第25-26页
    6 猪瘟病毒和疫苗毒株的细胞培养第26-29页
第二章 福建省猪瘟流行野毒株E2 基因序列分析第29-37页
    1 材料第29-30页
        1.1 毒株第29页
        1.2 引物设计与合成第29-30页
        1.3 试剂第30页
        1.4 仪器第30页
    2 方法第30-34页
        2.1 提取 RNA第30-31页
        2.2 RT-PCR 和nPCR第31-34页
            2.2.1 反转录合成cDNA第31页
            2.2.2 PCR 和nPCR第31页
            2.2.3 琼脂糖凝胶电泳第31页
            2.2.4 纯化回收DNA 片段第31-32页
            2.2.5 连接纯化产物与pMD18-T Vector第32页
            2.2.6 制备新鲜感受态细胞(CaCl2 法)第32-33页
            2.2.7 转化连接产物第33页
            2.2.8 提取重组质粒第33-34页
            2.2.9 重组质粒鉴定第34页
            2.2.10 计算机分析第34页
    3 结果第34-36页
        3.1 PCR 鉴定结果第34-35页
        3.2 重组质粒PCR 及酶切鉴定结果第35页
        3.3 猪瘟病毒 E2 基因核苷酸和氨基酸序列分析结果第35页
        3.4 核苷酸和氨基酸序列同源性比较第35-36页
    4 讨论第36页
    5 小结第36-37页
第三章 ST 多次传代 CSFV-Shimen 株的 E2 基因序列分析第37-45页
    1 材料第37-38页
        1.1 CSF 脾毒第37-38页
        1.2 CSF 细胞毒第38页
        1.3 试剂第38页
        1.4 主要仪器第38页
    2 方法第38-40页
        2.1 设计与合成引物第38页
        2.2 提取RNA第38-39页
        2.3 RT-PCR 和nPCR第39-40页
            2.3.1 反转录合成 cDNA第39页
            2.3.2 PCR 和 nPCR第39-40页
        2.4 琼脂糖凝胶电泳第40页
        2.5 纯化回收目的DNA 片段第40页
        2.6 连接纯化产物与PMD18-T Vector第40页
        2.7 制备新鲜感受态细胞第40页
        2.8 转化连接产物第40页
        2.9 提取重组质粒第40页
        2.10 重组质粒的鉴定第40页
    3 结果第40-42页
        3.1 目的基因的PCR 及酶切鉴定结果第40-41页
        3.2 目的基因序列及其氨基酸序列的比较结果第41-42页
    4 讨论与结论第42-43页
        4.1 选择E2 基因作为猪瘟病毒遗传变异检测的意义第42-43页
        4.2 ST 细胞用于猪瘟病毒的培养可以较好地保持 E2 基因的遗传稳定性第43页
    5 小结第43-45页
第四章 猪瘟Shimen 株E2 基因ST 细胞表达第45-52页
    1 材料第45-46页
        1.1 质粒与细胞第45页
        1.2 细胞培养试剂与酶第45页
        1.3 主要仪器与设备第45-46页
    2 方法第46-47页
        2.1 Shimen 株 E2 基因重组表达载体的构建与鉴定第46页
        2.2 pEGFP-Shimen 转染 ST 细胞及筛选第46页
        2.3 阳性细胞表达 E2 蛋白的免疫组化鉴定第46-47页
    3 结果第47-49页
        3.1 猪瘟Shimen 株E2 基因的克隆鉴定结果第47页
        3.2 pEGFP-Shimen 的 PCR 和酶切鉴定结果第47页
        3.3 阳性细胞E2 基因的PCR 鉴定结果第47-48页
        3.4 阳性细胞的荧光显微镜观察结果第48-49页
        3.5 阳性细胞表达E2 蛋白免疫组化鉴定结果第49页
    4 讨论第49-50页
        4.1 选择载体第49页
        4.2 优化细胞转染第49-50页
        4.3 优化目的基因表达第50页
    5 小结第50-52页
参考文献第52-57页
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