糖尿病大鼠肾脏组织中硫化氢合成酶水平的变化及硫化氢对肾脏系膜细胞增殖的作用研究

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糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的主要慢性并发症之一。其早期表现为肾脏肥大,肾小球及肾小管基底膜增厚,肾小球内高灌注、高跨膜压并逐渐进展为肾小球细胞外基质增生、肾小球硬化,进而发展为肾功能衰竭,已成为糖尿病患者主要死亡原因之一。DN的发病机制尚不十分清楚,目前认为是糖代谢异常、肾血流动力学改变、细胞因子改变及遗传背景等多因素共同作用的结果。近年来许多研究证实在DN时,肾脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)过度激活是本病变发展的关键因素之一,而控制RAS激活已成为治疗本病的重要措施。有报道高糖可以诱导肾小球系膜细胞和小管上皮细胞产生过量活性氧(reactive oxygen species, ROS),后者上调转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、进而导致细胞增生、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度表达等,引起细胞死亡和组织损伤。肾小球系膜细胞(mesangial cells,MCs)是肾小球内一种固有的血管外周细胞。大量实验显示MCs的异常增殖和ECM的异常合成和分泌是肾小球硬化最重要的前期表现之一。由此,本实验在离体培养的大鼠肾脏MCs给予高糖刺激,观察RAS激活对ROS增加引起TGF-β1、ECM表达上调这一途径的作用。近年来研究发现,生理浓度的硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)具有多种生理学功能,被认为是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)后的体内第三种气体信号分子,体内几乎所有的组织都能产生H2S,尤其在脑、心血管、肝和肾等组织,H2S合成水平较高。内源性的H2S是半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine -β- synthase, CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)和半胱氨酸转移酶催化作用下产生的。这三种酶在体内分布各不相同,肾脏中同时存在有CBS和CSE。然而目前对于H2S在肾脏中的生理作用报道非常少。因此,本实验在整体和细胞水平观察了高糖对CBS、CSE表达的作用,并通过外源性给予硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)研究H2S在高糖激活RAS引起ROS增加通路中的作用。在整体实验中,我们采用腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导产生糖尿病,糖尿病大鼠于第三周观察肾脏CSE、CBS改变,同时观察持续给予外源性NaHS一周,对糖尿病时肾脏早期改变的作用。在离体实验研究中,我们通过免疫荧光法观察培养的大鼠肾脏MCs上CSE、CBS的分布;荧光探针法检测细胞内ROS水平;酶联免疫分析法(enzyme immunoassay, EⅠA)测细胞培液中AngiotensinogenⅡ(AngⅡ)水平;用5-溴-2’脱氧尿嘧啶(BRDU)掺入法测细胞增殖。Real time PCR及Western-blot测组织、细胞或培液中CSE、血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)、血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin AT 1 receptor, AT1)、TGF-β1和CollagenⅣ表达。实验结果显示,STZ诱导糖尿病大鼠肾皮质中CSE mRNA水平在第三周时已出现显著降低;此外AGT、TGF-β1 mRNA水平明显增加;AT1受体mRNA水平显著降低;外源性给予NaHS可逆转上述现象,且可以抑制STZ组肾皮质CollagenⅣ的生成。在离体培养大鼠肾脏MCs上,我们观察到有CSE的分布;高糖刺激可抑制CSE的表达,引起AngⅡ和ROS水平的增加,上调TGF-β1和CollagenⅣ的表达,并促细胞增殖;外源性给予NaHS后可以抑制高糖引起的AGT、AngⅡ、AT1、TGF-β1、CollagenⅣ的表达、ROS的产生和抑制细胞增殖;给予CSE的抑制剂炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PAG)阻断H2S的产生,出现与高糖类似的作用,包括AGT、AngⅡ、AT1、TGF-β1、CollagenⅣ的表达增加、ROS的产生增多及促进细胞增殖等。另外,在高糖刺激前半小时给予AT1的受体阻断剂洛沙坦Losartan及NADPH氧化酶的拮抗剂(diphenylenechloride iodonium,DPI),可以抑制ROS的产生、TGF-β1、CollagenⅣ的表达和细胞增殖。以上结果提示,STZ诱导的糖尿病发病早期即有H2S合成酶CSE的变化。糖尿病早期CSE表达减少,与高糖引起的氧化应激发生有关。在糖尿病的早期,补充外源性H2S起到保护肾脏的作用。H2S的对肾脏的保护作用可能通过抑制高糖引起的AngⅡ的增加,进而抑制ROS的产生,下调TGF-β1和CollagenⅣ的表达,抑制系膜细胞的增殖,从而延缓肾小球硬化和肾脏纤维化。
摘要第4-6页
Abstract第6-7页
前言第9-11页
材料与方法第11-25页
实验结果第25-58页
讨论第58-62页
结论第62-63页
参考文献第63-67页
致谢第67-68页
附录 综述第68-75页
    参考文献第72-75页
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