[研究背景和目的]众所周知,二十一世纪世界各国最主要的死亡和致残原因是心血管疾病。根据目前的资料估测,至2020年,随着发展中国家生活水平的提高以及西方生活方式的普及,动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)形成的心血管疾病将是世界范围内最主要的死亡原因。动脉粥样硬化是慢性炎症性疾病,其特征为血管壁慢性炎症。单核／巨噬细胞是动脉粥样硬化血管病变部位最为重要的炎性细胞,也是粥样斑块的主要构成成分。单核细胞进入血管内膜下是动脉粥样硬化早期事件。血液中单核细胞在趋化因子作用下与受损的血管内皮细胞粘附,迁移到血管内皮下,转化为巨噬细胞。巨噬细胞摄取脂蛋白,聚积脂质,形成泡沫细胞,进一步形成动脉粥样硬化斑块。单核／巨噬细胞参与动脉粥样硬化形成的各个阶段,可能是动脉粥样硬化斑块形成的潜在生物标志物,被认为是动脉粥样硬化治疗的干预靶细胞。不对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)被认为是心血管疾病的一个新的危险因子。ADMA是一种强烈的内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂,抑制血管活性物质NO的合成,导致内皮功能障碍。内皮功能失调是动脉粥样硬化形成中的早期事件,是动脉粥样硬化发生的关键步骤。研究表明,血液循环中ADMA水平升高与内皮功能紊乱有关,动脉粥样硬化患者血液中ADMA水平明显升高,可能与动脉粥样硬化的形成有关。ADMA可能是多种危险因素导致动脉粥样硬化的共同作用机制之一,在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。临床研究发现：在患有高胆固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、肥胖、高半胱氨酸血症等动脉粥样硬化危险因素的患者,血浆ADMA浓度显著升高,存在相关性,提示ADMA可能是多种危险因素致动脉粥样硬化的一个作用环节。实验研究也发现,ADMA参与动脉粥样硬化形成的许多病理过程,包括有单核细胞粘附、促炎因子和趋化因子表达、氧化型—LDL在巨噬细胞内蓄积等。动脉粥样硬化形成过程中ADMA水平升高与PRMT/ADMA/DDAH通路有关。ADMA是由蛋白精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferase, PRMT)催化产生；大部分ADMA由肾脏二甲基精氨酸—二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)水解代谢,这一代谢过程我们称为PRMT/ADMA/DDAH通路。PRMT/ADMA/DDAH通路可能是动脉粥样硬化治疗的一个新的干预靶点。因此,本研究从整体水平上研究PRMT/ADMA/DDAH通路在大鼠动脉粥样硬化形成中的作用,从单核细胞迁移分化为巨噬细胞,形成泡沫细胞的环节入手,研究ADMA对动脉粥样硬化斑块形成过程中单核／巨噬细胞的作用,旨在阐明ADMA在动脉粥样硬化斑块形成中的作用机制,为防治动脉粥样硬化形成提供新的干预作用靶点。[研究方法]1.整体动物水平研究方法成年健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为3组：对照组,模型组和ADMA抑制剂组。模型组大鼠给予高脂饮食和一次性腹腔注射维生素D3。ADMA抑制剂组大鼠在高脂饮食基础上,给予ADMA抑制剂阿司匹林(30mg/kg/day)。对照组大鼠喂食基础饲料。各组大鼠按照上述方法喂养8周后处死检测各项指标。HE染色显微镜下观察主动脉病理变化。放射免疫法检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。ELISA方法测定血清ADMA、IL-8和TNF-α水平。RT-PCR和Western blot方法分别测定主动脉PRMT1和肾脏中DDAH1 mRNA和蛋白表达。2.细胞水平研究方法体外培养人单核细胞THP-1和人脐静脉内皮细胞HUVEC。细胞实验分组：阴性对照组和不同剂量ADMA组(3.75、7.5、15和30μmol/L)。测定ADMA作用不同时间单核细胞与内皮细胞粘附率。Transwell检测THP-1细胞迁移。MTT测定THP-1细胞增殖。流式细胞术测定THP-1细胞周期。采用160nmol/L的佛波脂诱导单核细胞THP-1分化为巨噬细胞。免疫组化方法鉴定巨噬细胞。加入100mg/L的ox-LDL诱导巨噬细胞分化为泡沫细胞。油红染色鉴定泡沫细胞。酶联比色法测定THP-1源巨噬细胞和泡沫细胞内胆固醇含量。RT-PCR和Wstern blot测定巨噬细胞ACAT-1和MIF mRNA和蛋白表达水平。ELISA方法检测THP-1源巨噬细胞分泌炎症细胞因子TNF-a和IL-8的水平。[研究结果]1.整体动物水平研究结果(1)病理组织学变化：模型组大鼠主动脉血管壁结构不清晰,内膜明显增厚,平滑肌细胞在内膜增生显著,可见泡沫细胞形成,平滑肌细胞排列不规则。(2)血脂水平：模型组和ADMA抑制剂组大鼠血清TC、TG和LDL-C水平明显高于对照组(P<0.05)；ADMA抑制剂组大鼠血清TC、TG和LDL-C水平明显低于模型组(P<0.05)。(3)血清ADMA水平：模型组大鼠血清ADMA水平明显高于对照组(P<0.05),ADMA抑制剂组大鼠血清ADMA水平明显低于模型组(P<0.05)。(4)血清炎症细胞因子水平：模型组和ADMA抑制剂组大鼠血清TNF-α和IL-8水平均明显高于对照组(P<0.05)。ADMA抑制剂组大鼠血清TNF-a和IL-8水平略低于模型组(P<0.05)。(5)主动脉PRMT1表达水平：与对照组比较,模型组大鼠主动脉PRMT1 mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),ADMA抑制剂组大鼠主动脉PRMT1 mRNA和蛋白表达也有所上调(P<0.05),但明显低于模型组(P<0.05)。(6)肾脏DDAH1表达水平：与对照组比较,模型组大鼠主动脉DDAH1 mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05),ADMA抑制剂组大鼠主动脉DDAH1 mRNA和蛋白表达也有所下调(P<0.05),但明显高于模型组(P<0.05)。(7)相关性分析：血脂水平与血清ADMA水平呈正相关,血清TC、TG、LDL-C水平与ADMA相关系数分别为0.859、0.887、0.845;血清炎症细胞因子TNF-α和IL-8水平与ADMA水平也呈正相关,相关系数分别为0.924和0.876。2.细胞水平研究结果(1) ADMA对单核细胞的粘附、迁移、和增殖作用：不同浓度ADMA (3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L和30μmol/L)与THP-1细胞作用不同时间,能够促进THP-1细胞与内皮细胞的粘附、迁移和增殖(P<0.05),呈时间和剂量依赖性。(2)ADMA对THP-1源巨噬细胞和泡沫细胞胆固醇含量的影响：与对照组相比,3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L和30μmol/L ADMA作用THP-1源巨噬细胞和泡沫细胞不同时间(6h、12h和24h),细胞内胆固醇含量明显升高(P<0.05),呈时间和剂量依赖性。(3)ADMA对THP-1源巨噬细胞ACAT-1mRNA和蛋白表达的影响：0、3.75、7.5、15、30μmol/L的ADMA作用THP-1源巨噬细胞24h,随着ADMA浓度的增高,ACAT-1mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),呈浓度依赖效应；15μmol/L ADMA作用下ACAT-1表达水平最高(P<0.05)；15μmol/LADMA作用THP-1源巨噬细胞0、6、12、24h,随着时间的延长,ACAT-1的表达上调(P<0.05),呈时间依赖效应。(4) ADMA对THP-1源巨噬细胞MIF mRNA和蛋白表达的影响：0、3.75、7.5、15、30μmol/L ADMA作用THP-1源巨噬细胞24 h,随着ADMA浓度的增高,MIF mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05),呈浓度依赖效应；15μmol/L ADMA作用下,MIF mRNA和蛋白表达最高(P<0.05)。(5) ADMA对THP-1源巨噬细胞分泌TNF-a和IL-8的影响：3.75、7.5、15、30μmol/L ADMA作用THP-1源巨噬细胞24h,细胞培养上清中TNF-α和IL-8含量明显升高(P<0.05)；15μmol/L ADMA作用下,细胞培养上清中TNF-α和IL-8含量最高(P<0.05)。[结论]1.动脉粥样硬化大鼠血清ADMA水平明显升高,血脂水平升高可能是导致ADMA水平升高的重要因素。2.动脉粥样硬化大鼠主动脉PRMT1 mRNA和蛋白表达明显上调,肾脏DDAH1 mRNA和蛋白表达明显下调,ADMA水平明显升高是PRMT/ADMA/DDAH通路代谢失调的结果。3.动脉粥样硬化大鼠血清中炎症细胞因子TNF-α和IL-8水平明显升高,与ADMA水平呈正相关,抑制ADMA水平可以降低血清TNF-α和IL-8水平,ADMA可能是一个新的重要的促炎因子。4. PRMT/ADMA/DDAH通路在动脉粥样硬化形成过程中起着重要作用,可能是抗动脉粥样硬化作用新的潜在靶点。5. ADMA能够促进体外培养的单核细胞(THP-1)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附、迁移和增殖。6. ADMA能够上调THP-1源巨噬细胞内ACAT-1mRNA和蛋白表达,增加人THP-1源巨噬细胞内胆固醇的含量,促进胆固醇在细胞内聚积,增加泡沫细胞的形成,引起典型的THP-1源泡沫细胞形态学特征。7. ADMA增加THP-1源巨噬细胞吞噬脂质的能力和细胞内胆固醇含量的作用可能与上调ACAT-1表达有关。8. ADMA能够明显上调THP-1源巨噬细胞MIF mRNA和蛋白的表达,促进巨噬细胞分泌IL-8和TNF-α,从而促进动脉粥样硬化斑块的形成。9. ADMA可能是促进THP-1源巨噬细胞和泡沫细胞形成的重要因素,干预ADMA可作为防治动脉粥样硬化斑块形成的新策略。
