牛病毒性腹泻病病毒中国毒株E2基因的鉴定及表达E2蛋白的抗原性研究

应用RT-PCR及套式PCR克隆得到BVDV长春184株、ZM-95株E2基因片段，测序分析结果表明，长春184株E2基因长度为1122bp，编码一个374个氨基酸残基的多肽；ZM-95株E2基因长度为1125bp，编码一个375个氨基酸残基的多肽。序列分析结果表明这两个毒株均属BVDVⅠ型，184株属Ⅰb亚型，其E2基因与Osloss株E2基因同源性为91.8％，而与NADL株CV24株E2基因的同源性为69.9％；ZM-95株与NADL、属Ⅰa亚型，其E2基因与NADL、Oregon CV24 E2基因同源性为71.2％，与Osloss E2基因的同源性为69.9％。两个毒株E2基因与CSFV石门株和BDV x818株E2基因的同源性为52.1％。在ZM-95株E2基因片段的第167bp-176bp之间有三个碱基的不连续插入，造成这一小段序列发生移码突变，导致该区域基因编码的多肽链有一个组氨酸的插入及随后几个氨基酸的变异，这一段HYKKK肽序列为ZM-95所特有。 通过特异引物扩增BVDV长春184株E2基因，将该基因克隆到pGEM-5Zf(+)载体，得到pGEM-5Zf-BE2质粒并测序，然后将E2基因分别亚克隆到pET28a(+)和pBV220载体，构建了原核表达质粒pET28a-BE2和pBV220-BE2，将这两个质粒转化大肠杆菌HMS174(DE3)和DH5α并诱导表达，表达目的蛋白含量分别占菌体总蛋白的6.25％和3.28％。在此基础上，通过去除E2基因跨膜区序列，构建得到pET28a-BE2m和pBV220-BE2m,将这两个质粒转化大肠杆菌并诱导表达结果显示重组菌表达的目的蛋白分别占菌体总蛋白为35.7％和8.96％。对BVDV和CSFV E2蛋白的抗原性比较分析结果显示二者之间存在明显的差异，因此，我们用电泳方法纯化了重组BVDV E2蛋白和重组CSFV E2蛋白并用纯化蛋白免疫家兔，制备得到BVDV E2蛋白和CSFV E2蛋白特异的高免血清，间接ELISA检测结果表明，兔抗重组BVDV E2高免血清和重组CSFV E2蛋白反应值很低；与CSFV特异重组表位肽不反应；同样，兔抗CSFV E2高免血清可与重组CSFV表位肽反应而与重组BVDV E2蛋白反应值很低。这一结果表明我们得到的E2基因和重组蛋白为进一步应用血清学方法研究鉴别BVDV或CSFV的感染打下了良好的基础。