水稻内外稃发育调控基因BLS1的图位克隆及功能分析

水稻等禾本科植物具有与双子叶植物不同的花器官结构，典型的双子叶植物花器官从外到内依次为花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，水稻雄蕊和雌蕊与单子叶植物相似，而外层的内外稃和浆片是禾本科植物特有的。目前，关于水稻内外稃起源和发育的分子机理还知之甚少。本研究以从T-DNA插入突变体库和自发突变体库中获得的具有鹰嘴（beak like spikelet，bls1）表型的水稻内外稃发育突变体bls1-1与bls1-2为材料，通过图位克隆和基因功能分析，揭示了引起鹰嘴表型的遗传与分子机理，加深了我们对水稻内外稃发育分子机制的认识。主要结果如下：1. bls1突变体内外稃变小，特别是内外稃上部明显变窄、变尖，整朵小花形成类似鹰嘴的形状，而其它花器官，包括退化颖片、护颖及内部浆片、雄蕊和雌蕊的形态正常，没有发生花器官同源转化现象。石蜡切片观察发现，突变体内外稃从外到内四种类型细胞（硅化细胞、纤维状厚壁组织、薄壁细胞、未硅化细胞）都明显变小，统计未硅化细胞数目和细胞面积时发现，突变体内外稃细胞面积显著减小。扫描电镜观察发现，突变体花器官原基的起始与花器官轮生模式的形成过程正常，只是在胚珠和花粉形成期（Sp8期）内外稃不膨大，横向生长受到抑制。2.通过Real-time PCR分析，发现内外稃发育相关的花器官特征基因，包括AP1-like基因、SEP-like基因、AGL6-like基因，在突变体中的表达不受影响。由此推测，BLS1基因可能位于这些花器官特征基因下游，与突变体bls1没有发生同源转化的表型结果一致。此外，其它内外稃发育相关基因，包括REP1、DP1、DL基因在突变体中正常也表达，BLS1可能是从新的途径调控内外稃的发育。3.遗传分析表明，鹰嘴表型由一对隐性核基因控制。以bls1-1×Dular杂交组合获得的定位群体，将bls1定位在第2染色体长臂约110kb的区间内，在该区间内，bls1-1突变体大约有87kb的染色体片段缺失。再利用bls1-1等位突变体bls1-2与培矮64配置的群体进行精细定位，最终将bls1位点定位在大约65kb的区间内，bls1-2突变体在定位区间内也存在50kb染色体片段缺失。定位区间内包括7个基因，经过测序和RT-PCR表达分析发现，只有LOC_Os02g56610能够在水稻幼穗中表达，将该基因确定为候选基因BLS1。互补实验和干扰实验结果证明bls1突变体的鹰嘴表型是由BLS1基因缺失造成的。4. BLS1基因编码287个氨基酸，包含一个DUF640结构域。通过数据库搜索发现，DUF640结构域可能是陆生植物特有的。转基因植株GUS组织染色结果表明，GUS活性在幼穗中最强，特别是幼穗的内外稃，该结果与Real-time PCR基因组织特异性表达分析结果一致。瞬时表达和转基因结果都表明，BLS1蛋白定位在细胞核上。