颈脊髓空洞症时骶棘肌失神经支配、脑脊液流动性改变与胸椎侧凸的相关性研究--基于突触后膜AChR检测及SAS脑脊液动力学参数测定的研究

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目的:1.在化学致炎剂Kaolin诱导的非交通性颈脊髓空洞伴发胸椎侧凸兔模型基础上,针对侧凸发生早期的关键时相点,重点关注顶椎区脊柱两侧椎旁肌内的变化,分别从运动神经终末分支、神经肌肉接头受体表达和肌纤维形态的角度,分析骶棘肌失神经支配的不平衡是否为颈脊髓空洞所伴发胸椎侧凸的主要原因;2.采用脑脊液糖蛋白示踪和核磁共振流体定量技术,探讨脑脊液在脊髓血管周围间隙及蛛网膜下腔流动特性的改变与脊髓空洞、脊柱侧凸发生和演变间的相互影响;3.通过探索颈脊髓空洞症时骶棘肌失神经支配、脑脊液流动性改变与胸椎侧凸的相关性,为逐步深入研究颈脊髓空洞与伴发胸椎侧凸间的因果联系建立基础。方法:第一部分Kaolin诱导兔非交通性颈脊髓空洞伴发胸椎侧凸新型模型的构建1.动物分组:以46只日本大耳白兔,随机分为假手术组(8只)、生理盐水组(8只)和实验模型组(30只);2.建模:假手术组建模以2%戊巴比妥钠10-15mg/kg静脉麻醉,经后路显露颈7椎板后,切除0.3-0.4cm2椎板,以微量注射器自硬膜囊后正中旁开左侧lmm穿刺,深度1.0-1.5mm,维持针头位置3分钟后缓慢退针:生理盐水组建模则在上述穿刺后,以60μl生理盐水于2分钟内缓慢推注,并维持针头位置1分钟后缓慢退针;实验模型组建模以等量25%Kaolin液替代生理盐水行推注。3.观察:于术前、术后3天、2周、4周、8周时分别行改良的Tarlov评分以评估兔的肢体运动功能;4.脊髓空洞的检测:分别于术后4周、6周、8周及12周,以1.5T超导核磁共振仪于TR/TE值230/26ms、8000/264ms条件下,行兔颈脊髓矢状位和颈1-胸6轴位扫描,动态观察颈脊髓空洞的发生和进展情况;分别于术后6周、8周、12周时在MRI显示空洞的动物中随机选择1只动物,经左心4%多聚甲醛灌注处死后,在颈脊髓穿刺区及空洞区轴位切片,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)染色,×100光镜下观察中央管、室管膜及其周围脊髓实质的变化;5.胸椎侧凸的检测:分别于术后4周、6周、8周、10周及12周,以数字减影x线摄片机摄脊柱正位片。记录发生的侧凸形态,并以Cobb法测量侧凸角度;第二部分兔非交通性颈脊髓空洞伴发胸段侧凸早期椎旁骶棘肌失神经支配的对称性的研究1.动物分组:第一部分实验造模的20只日本大耳白兔,依MRI及x线检测到畸形的状态不同分为无侧凸或空洞发生的对照组(8只)、单纯空洞组(3只)和侧凸组(9只)。2.取材:在侧凸被检测到第2或4周时相点,于胸8节段或主弯顶椎区,左右两侧对称切取0.5x0.5x3.0cm3椎旁骶棘肌;3.肌纤维结构观察:HE染色×100-200光镜下观察肌纤维的肌源性及神经源性病变,并以扫描电镜观察椎旁肌失神经支配的超微结构变化;4.运动神经终末分支观察:椎旁肌运动终板神经镀银染色,统计并计算轴突终末支配比率(Terminal innervation ratio,TIR);5.神经肌肉接头受体表达检测:针对椎旁肌神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor, AChR)γ亚基表达水平进行检测,在总RNA提取后,分别行浓度和纯度测定,继以总RNA为模板进行cDNA第一链合成,再以ABI荧光定量PCR仪7000型,采用SYBR GREEN法相对定量检测目的基因表达,计算2-ΔΔCT值;6.所有检测结果均行凸凹侧对比。第三部分兔非交通性颈脊髓空洞伴发胸椎侧凸早期脊髓内脑脊液糖蛋白迁移的示踪观察1.动物分组:第一部分实验造模的20只日本大耳白兔,以MRI及x线检测到畸形的状态不同分为无侧凸或空洞发生的对照组(8只)、单纯空洞组(3只)和侧凸组(9只)。2.枕大池穿刺注射生理性示踪剂辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP):在侧凸被检测到第2或4周时相点,分别行经皮枕大池穿刺,3%HRP计500μl于2分钟内缓慢注入蛛网膜下腔(Subarachnoid space, SAS);3.检测:推注完成后10分钟,采用4%多聚甲醛快速脊髓灌注,颈段脊髓取材并切片,二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)显色,于×100-200光镜下观察脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)经脊髓血管周围间隙(Perivascular spaces,PVS)向脊髓实质内的迁移范围及分布。第四部分:经后路全脊椎切除术对颈脊髓空洞伴发脊柱侧凸青少年患者脑脊液动力学影响的研究1.研究对象分组:23例研究对象,包括正常对照组(10例)、单纯空洞组(5例)和伴发有脊髓空洞的脊柱侧凸组(8例);2.检测:所有研究对象均采用同步心电门控下相位对比电影磁共振(Phase Contrast cine Magnetic Resonance Image,PC-cine MRI)技术,行SAS内CSF流体动力学参数测定。以1.5T超导核磁共振仪于TR/TE值32-50/6.9 ms和75/16ms条件下正中矢状位及轴位扫描;分别取轴位的枕骨大孔、颈7、胸7(或顶椎)和腰1椎体中份水平进行测定;使用Argus流动分析软件,测量及计算参数包括:CSF从头端流向尾端时相的持续时间(DF)、从尾端流向头端时相的持续时间(UF)、DF/一次循环时间(DF%),UF/一次循环时间(UF%)、DF起始时间/一次CSF循环时间(DS%)、潜伏期/一次CSF循环时间(SP%)、CSF向下流动最大流速(VDmax)、向上流动最大流速(VUmax);绘制最大流速/时间曲线;行组间比较;3.干预:脊柱侧凸组均未行枕颈区神经减压而选择一期经后路全脊椎切除(Posterior vertebral column resection,PVCR)脊柱短缩矫形术;4.干预后检测:术后3周再次行枕骨大孔、颈7的PC-cine MRI检测,并与术前比较。统计学分析以SPSS11.0软件进行统计学分析。计量资料组间比较以成组t检验,组内比较以配对t检验;选择P<0.05为有统计学差异。结果:1.第一部分1.实验模型组动物有3只于术后2周内死亡;6只自造模后2周起逐渐出现后肢无力、活动受限,至术后8周Tarlov评分2.50;2.在18只持续观察12周的模型兔中,于造模后第6周开始出现颈脊髓空洞,不伴脑积水或第四脑室扩张,至12周时发生率66.7%;3.造模后第8周开始发生胸椎侧凸,至12周时发生率50.0%,平均Cobb角35.09°±13.22°(18°-68°);4.随时间推移,空洞直径逐渐增大;所有侧凸均与脊髓空洞伴发,侧凸分别在MRI显示脊髓空洞发生的同时(2只)、2周后(5只)及4周后(2只)被观察到;侧凸类似临床常见的脊髓空洞伴发的侧凸形态;随时间推移,侧凸角度逐渐增大。5.其余2组未检测到空洞或侧凸发生。2.第二部分1.侧凸组动物在侧凸发生早期存在椎旁肌失神经支配表现,以肌纤维角状萎缩及亚细胞结构紊乱、运动终板轴突末梢分支增加、及突触后膜AChR的γ亚基表达上调等为特征;2.侧凸组动物凸凹侧对比差异均不明显,包括光镜及电镜下肌纤维的结构、TIR值(凸侧1.14±0.18,凹侧1.17±0.36)和2-ΔΔCT值(凸侧1.628±0.002,凹侧1.729±0.003)。3.第三部分所有动物均观察到在颈脊髓PVS内有HRP反应产物的聚集;在正常对照组动物HRP反应产物主要位于背侧脊髓白质;单纯空洞组动物可见明显的灰质内扩散;侧凸组动物表现为PVS增宽,中央灰质和腹、背侧白质内的HRP反应产物广泛分布,且HRP反应产物具有中央管趋向性。4.第四部分1.PC-cine MRI结果显示,颈脊髓空洞患者的CSF动力学表现为有特征性的低动力学特点,由颅内向椎管内流动受阻;2.伴发脊柱侧凸时,在枕骨大孔区向下流动的低动力表现更为明显;在颈脊髓平面有显著的向下流动起始延迟;在顶椎区则表现了高动力学特点;3.行PVCR脊柱矫形术后3周与术前相比,在颅颈交界区的CSF动力学由异常而转为趋近于正常;术后随访可观察到脊髓空洞缩小现象。结论:1.于颈7脊柱节段相应脊髓实质内注射Kaolin,诱导了兔非交通性颈脊髓空洞形成,同时观察到胸段结构性、进展性脊柱侧凸的发生。该动物模型与临床接近,构建操作简单,验证手段成熟;为进一步有关脊髓空洞伴发脊柱侧凸的动物研究提供了较为理想的平台。2.尽管在畸形发生早期存在椎旁骶棘肌的失神经支配情况,但空洞伴发的脊柱侧凸不一定源于双侧不平衡的神经支配,应有其他病理机制的参与。3.兔胸段脊柱侧凸发生早期,CSF经颈段脊髓PVS途径向空洞内流入明显增加。CSF经PVS的动力学改变影响了脊髓空洞的发生及发展,脊柱侧凸又加剧了兔颈段脊髓内CSF动力学改变。4.首次对脊髓空洞伴发脊柱侧凸的患者SAS内的CSF动力学参数进行对比研究。脊髓空洞患者存在颅颈交界区CSF动力学障碍;伴发脊柱侧凸时,脊髓牵张使颅颈交界区CSF循环的梗阻加重,对空洞的发生和发展产生影响。5.首次对伴发脊髓空洞的脊柱侧凸患者未行枕颈区神经减压而行一期脊柱短缩矫形PVCR术。PVCR术在获得有效脊柱畸形矫正的同时,通过缓解脊髓牵张,改善了颅颈交界区CSF动力学障碍,有利于脊髓空洞的缩小
英文缩略词表第6-8页
中文摘要第8-13页
英文摘要第13-19页
引言第20-24页
第一部分 Kaolin诱导兔非交通性颈脊髓空洞伴发胸段脊柱侧凸新型模型的构建第24-42页
    前言第24页
    材料与方法第24-28页
    结果第28-36页
    讨论第36-41页
    结论第41-42页
第二部分 兔非交通性颈脊髓空洞伴发胸段侧凸早期椎旁骶棘肌失神经支配的对称性的研究第42-64页
    前言第42-43页
    材料与方法第43-49页
    结果第49-58页
    讨论第58-63页
    结论第63-64页
第三部分 兔非交通性颈脊髓空洞伴发胸椎侧凸早期脊髓内脑脊液迁移的示踪观察第64-75页
    前言第64页
    材料与方法第64-67页
    结果第67-70页
    讨论第70-74页
    结论第74-75页
第四部分 经后路全脊椎切除术对颈脊髓空洞伴发脊柱侧凸青少年患者脑脊液动力学影响的研究第75-108页
    前言第75-76页
    材料与方法第76-83页
    结果第83-96页
    讨论第96-106页
    结论第106-108页
参考文献第108-120页
综述 伴发脊髓空洞的脊柱侧凸研究进展第120-135页
    综述参考文献第130-135页
攻读学位期间发表文章情况第135-136页
致谢第136页
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