HSP60诱导免疫耐受抗动脉粥样硬化的作用机制实验研究

热休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）是由受刺激以及死亡的内皮细胞分泌和释放的一种蛋白。动脉内皮细胞受外界因素如应激、高血压、感染等刺激时可引起HSP60的表达，被树突状细胞、淋巴细胞所识别，从而触发自身免疫反应。近年来HSP60与动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的关系越来越引起国内外学者的关注，许多研究表明HSP60在AS发病中发挥重要作用，可作为自身抗原引发血管壁的免疫反应，启动AS的形成并促进AS进一步发展。本课题将HSP60作为耐受原，从新角度研究口服HSP60诱导免疫耐受和抗AS的作用机制，对比AS造模前口服HSP60组（预防组）和造模后口服HSP60组（治疗组）在诱导免疫耐受、抗AS及改善心肌缺血性损伤方面的异同点，探讨口服HSP60的给药时机,是否具有预防和治疗双重功效？为预防和治疗AS和缺血性心脏病提供新策略。1、探究口服HSP60诱导免疫耐受具体机制（第一部分实验要解决的研究问题）；2、探究口服HSP60抗动脉粥样硬化机制（第二部分实验要解决的研究问题）。1、取出生后30天（1月龄）SD雄性大鼠40只，体重100±10g，随机分为4组：健康对照组（C组），AS未干预组（AS组），AS造模前口服HSP60组(预防组，H1组),AS造模后口服HSP60组（治疗组，H2组），以上每组10只；2、第一部分实验通过用免疫组化、流式细胞技术、ELISA法检测上述四组大鼠主动脉、脾淋巴结组织和外周血CD4+、CD8+、IL-10、TGF-β及调节性T细胞（Treg）含量，评价口服HSP60诱导产生免疫耐受的情况；3、第二部分实验通过用酶比色法检测各组血脂；经HE染色后，用透射电镜和图像分析系统观察各组主动脉及心肌病理改变，计算血管内膜（intimalthickness,IT）与血管内径(inner diameter,ID)之比；用免疫组化、RT-PCR和Western blot蛋白印迹法观察、分析各组主动脉根部CD36、SR-A、NF-κB、HSP60表达及心肌VEGF和HIF-1α基因和蛋白表达情况；ELISA法检测各组血清HSP60、MMP-9、hs-CRP含量。4、对各项指标进行统计学分析，做相关性研究。从组织形态学、蛋白学、基因学、血清学、免疫学、超微结构多角度研究口服HSP60诱导免疫耐受抗动脉粥样硬化的具体机制。1、第一部分实验结果：H1组和H2组CD8+抑制性T细胞、CD4+CD8+Foxp3+ Treg细胞在外周血和脾淋巴组织中含量增加，Treg细胞分泌的具有抑制免疫、诱导免疫耐受的TGF-β和抑制特异性效应T细胞的IL-10等细胞因子在外周血中的含量也增加。相反,AS组上述指标在降低，且各指标相互之间均成正相关。CD4+辅助性T细胞含量在H1组和H2组表现为下降，在AS组表现为增加，与上述各指标间成负相关。本实验结果显示，口服HSP60能够产生免疫耐受，且H1组较H2组诱导免疫耐受效果更好，提示越早口服HSP60诱导免疫耐受效果越好（P均<0.05）。2、第二部分实验结果：口服HSP60并不能降低血脂，但能减轻动脉内膜增厚程度，且越早用药效果越好；光镜下AS组主动脉根部内膜明显较C组增厚，平滑肌细胞增生、排列紊乱，炎性细胞、泡沫细胞浸润，肌纤维断裂，可见动脉粥样硬化斑块；心肌组织也有相应损伤性改变，心肌肌纤维结构紊乱、肌细胞间隙增宽，间质水肿等，电镜下可见心肌线粒体肿胀、线粒体嵴结构紊乱、断裂等。H1组和H2组血管及心肌病变程度较AS组为轻，且H1组病损轻于H2组，提示越早口服HSP60，抗动脉粥样硬化效果越好；免疫组化、RT-PCR、Western blot和ELISA检测结果显示，AS组主动脉HSP60、SR-A、CD36、NF-κB、心肌VEGF、HIF-1α基因蛋白表达及血清中HSP60、MMP-9、hs-CRP含量较对照组明显增高，口服HSP60组能明显降低上述各指标的表达程度，且H1组表达低于H2组，同样提示越早口服HSP60，抗AS效果越好。相关性分析结果显示：各组组内血脂与血管IT/ID，主动脉和血清中HSP60与血管IT/ID，主动脉HSP60与其SR-A、CD36、NF-κB表达，血管IT/ID与主动脉SR-A、CD36、NF-κB表达，血脂与主动脉、血清HSP60，主动脉、血清HSP60含量与心肌VEGF、HIF-1α表达，血清HSP60含量与MMP-9、hs-CRP含量，主动脉HSP60蛋白表达与主动脉SR-A、CD36、NF-κB、心肌HIF-1α、VEGFmRNA基因表达水平之间均存在正相关性（P均<0.05）。1、第一部分实验结果表明，口服HSP60能够诱导免疫耐受，其机理可能为：HSP60作为耐受原，经口服与胃肠粘膜接触，作用于肠道相关淋巴组织（GALT）中,刺激CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增多，通过其分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等产生对HSP60抗原特异性的免疫耐受（无应答或低应答反应），进而可以减少局部免疫炎症反应，且越早期口服HSP60，越易诱导免疫耐受。2、第二部分实验证明口服HSP60能够抗AS，其机理是：口服HSP60诱导免疫耐受后，能够①抑制动脉免疫炎症反应，表现为NF-κB、hs-CRP含量下降；②减少内膜损伤及自身HSP60抗原的暴露，表现为主动脉HSP60表达、血清HSP60含量降低；③降低自身免疫反应程度，从而减少血管内膜增厚程度，表现为血管IT/ID下降；④抑制平滑肌增生，表现为平滑肌清道夫受体SR-A基因及蛋白表达下降；⑤减少泡沫细胞和粥样斑块形成，表现为巨噬细胞CD36基因及蛋白表达下降，光镜和电镜下观察斑块明显减少；⑥改善心肌供血，表现为心肌血管内皮生长因子VEGF和乏氧诱导因子HIF-1α的基因和蛋白表达降低，光镜和电镜下见心肌病损减轻；⑦维持纤维斑块的稳定性，表现为血清基质金属蛋白酶MMP-9含量减低，降解斑块纤维帽和动脉内膜基质、破坏斑块完整性和稳定性能力下降。3、经研究发现，口服HSP60耐受原具有预防和治疗AS双重功效，造模前和造模后口服HSP60，血管内膜及平滑肌增生均减低，管腔狭窄均有不同程度改善，且造模前口服HSP60效果优于造模后，即越早口服HSP60，抗AS效果越好。4、实验亦发现仅仅依靠口服HSP60耐受原，并不能完全阻止和根治AS，口服HSP60组仍然存在血管内膜和平滑肌增生现象，可能与口服HSP60只是诱导针对HSP60特异性的免疫耐受，只能抑制由HSP60引发的免疫炎症，而对血脂增高、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）引起的免疫炎症效果不佳，故建议联合使用多种主要耐受原,如HSP60、ox-LDL等,诱导对应的免疫耐受，加之降血脂药物，如他汀类药物；去除AS致病原—高血脂，才能取得更好的防治AS效果，本人也正在进行该方面的实验研究，期望能为广大动脉粥样硬化心脑血管病患者早日带来福音。