第一部分apM1基因真核表达重组体的构建与表达目的：构建稳定的含人脂联素基国apM1的真核表达载体,探究脂联素转染入体外培养的脂肪细胞和血管内皮细胞并在其内的表达情况,为脂联素用于体内干预动脉粥样硬化的研究奠定基础。方法：自人心外膜脂肪组织提取总RNA, RT-PCR扩增apMl片段,克隆入载体pcDNA3.1中,形成pcDNA3.1-apMl重组体,经酶切电泳鉴定后对其进行测序。体外培养脂肪细胞和脐静脉内皮细胞,脂质体包裹的pcDNA3.1-apMl瞬时转染两种细胞,运用蛋白免疫印迹技术(Western Blot)确定其有效表达。结果：重组质粒pcDNA3.1-apMl经测序鉴定正确,pcDNA3.1-apMl瞬时转染入体外培养的脂肪细胞和脐静脉内皮细胞,转染48h后,经Western Blot检测脂联素可有效表达,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。结论：成功制备了apM1基因真核表达重组体；瞬时转染入体外培养的脂肪细胞和脐静脉内皮细胞后apM1基因可有效表达,为脂联素进一步用于体内干预动脉粥样硬化的研究提供了高效的技术方法。第二部分兔心外膜脂肪转染apMl基因对冠状动脉粥样硬化形成的影响目的：拟研究人脂联素基因apMl的兔心外膜脂肪转染,以及对高脂喂食兔冠状动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)形成的影响。方法：制备兔冠状动脉粥样硬化模型,随机分为四组：正常对照组、高脂喂食组、高脂转空质粒组、高脂转apMl组。心包腔内注射脂质体包裹的pEGFP-apMl重组质粒50μl,分别于注射后2、7、28d,行兔心外膜脂肪组织快速冰冻切片,荧光显微镜及免疫组织化学检测转染效率及表达。转染采用第一部分所选择的方法,于转染后4周,采用Western blot检测心外膜脂肪组织脂联素水平、采用全自动生化分析仪测定外周血总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度,采用ELISA法检测外周血及心包腔液中脂联素和TNF-a的水平,采用HE染色检测冠状动脉内膜/中膜厚度比。结果：心包腔内转染apMl基因2天后即可检测到兔心外膜脂肪组织apM1基因高表达,7天后仍显示高表达,表达可持续至28天；心外膜结缔组织及心肌细胞未见有效转染。心外膜脂肪局部转染及表达脂联素对高脂喂食引起的外周血脂联素、TNF-α、TC、HDL-C及LDL-C含量的改变均无显著影响；与高脂喂食组比较,心外膜脂肪局部转染脂联素可使心包腔液中脂联素含量显著增加、TNF-a水平显著降低(p<0.01),冠状动脉内膜/中膜比较高脂喂食组减小40.66%。结论：经心包腔注射可将apMl基因有效转染入心外膜脂肪组织；心外膜脂肪组织脂联素表达增加,可在局部通过抑制高脂诱导的炎性因子释放而抑制冠状动脉粥样硬化的形成。第三部分声诺维介导人apM1基因的兔主动脉内转染及表达目的：采用超声微泡声诺维介导apM1基因的兔主动脉转染及表达,为脂联素用于体内干预动脉粥样硬化提供一种无创、无毒副作用、可重复操作的转染技术,为临床研究和治疗开拓新的领域。方法：将成功构建且经体外实验验证能有效表达的pcDNA3.1-apMl重组体,与声诺维混合后的混合物经兔耳缘静脉注射,同时采用诊断超声仪照射兔胸腹主动脉处3 min,分别于照射后2,7,14d取兔主动脉血管及血清,用Western Blot检测兔主动脉中apM1基因的表达,ELISA检测血清中apM1蛋白含量、肿瘤坏死因子α、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平变化。结果：经兔耳缘静脉注射pcDNA3.1-apMl与声诺维的混合物后,Western Blot检测显示声诺维传输apM1基因2d后即可检测到兔主动脉apM1基因高表达,7d后仍显示高表达,表达可持续至14 d。ELISA检测显示声诺维传输apM1基因可显著增加兔血清apM1蛋白含量(P<0.01),而肿瘤坏死因子α水平无显著影响,同时总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平亦无显著影响。结论：声诺维可在快速血流状态下,安全、高效传输apM1基因入兔主动脉血管壁并有效表达与分泌,且对机体无明显毒副作用,建立了一种新的apM1基因在体无创无毒传输技术,为脂联素进一步用于体内干预动脉粥样硬化的研究提供了新的技术方法。
