第一部分小鼠胰岛的分离、纯化及鉴定目的研究小鼠胰岛的分离、纯化方法。方法采用多点注射灌注胶原酶消化胰腺,不连续密度梯度离心,联合人工挑取的方法纯化胰岛；台盼蓝染色观察胰岛活性,双硫腙(Dithizone, DTZ)对胰岛进行特异性染色计算胰岛的产量及纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放实验(GSIS)检测胰岛的功能。结果分离纯化后每只小鼠平均得到(114±15)个胰岛,平均纯度为(77.12±3.23)%,胰岛细胞活率>90%。胰岛细胞对葡萄糖刺激反应良好,每约20个胰岛体外培养液中胰岛素水平在无糖、低糖(2.8mmol/L)和高糖(22.2mmol/L)刺激下分别为(23.80±3.52)μ IU/ml、(67.57±4.04)μ IU/mL和(164.32±10.75)p IU/mL。各组间比较,差异有统计学意义(F=322.36,P<0.05)；两两比较,低糖组的胰岛素水平为无糖组的2.84倍(t=-14.15,P<0.05),高糖刺激组的胰岛素水平为低糖刺激组的2.43倍(t=-14.59,P<0.05),高糖刺激组的胰岛素水平为无糖组的6.90倍(t=-21.51,P<0.05)。结论采用多点注射灌注胶原酶消化胰腺,不连续密度梯度离心,联合人工挑取的方法纯化所得的小鼠胰岛产量及纯度较高、形态完整、能够感受不同浓度葡萄糖刺激,是一种简便高效的胰岛分离纯化方法。第二部分炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响目的研究炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ对小鼠胰岛葡萄糖刺激下胰岛素分泌反应的影响。方法采用第一部分的方法分离纯化后所得的小鼠胰岛,经过夜修复后,手工挑取形态正常、包膜完整、大小相近的胰岛接种于24孔板(每孔约20个,共8孔),48小时后加入IL-1β(0.25ng/ml、2.5ng/ml)和/或IFN-γ(100u/m1、1000u/m1),细胞因子作用24小时后,换用无糖KRBH缓冲液培养30分钟,再在含22.2mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育1小时,收集上清,放射免疫分析法检测胰岛细胞上清液中胰岛素浓度。结果细胞因子作用于小鼠胰岛24小时后,对照组的胰岛素浓度为(40.61±0.74) uIU/ml,单纯葡萄糖(22.2mmol/L)刺激组的胰岛素释放量为(142.48±1.22)uIU/ml,组间比较差异具有统计学意义(t=-123.669,P<0.05)；IL-1β (0.25ng/ml、2.5ng/ml)组在高糖(22.2mmol/L)刺激下胰岛素释放量为(113.83±5.65)uIU/ml及(91.01±2.62)uIU/m1,与单纯葡萄糖刺激组相比,胰岛素释放量分别下降20%[(113.83±5.65)对(142.48±1.22)uIU/ml,t=8.759,P<0.05]及36%[(91.01±2.62)对(142.48±1.22)uIU/m1,t=30.874,P<0.05]；IFN-γ(100u/m1、1000u/m1)组高糖(22.2mmoI/L)刺激下胰岛素释放量为(116.09±6.11)uIU/ml及(71.78±3.51)uIU/ml,与单纯葡萄糖刺激组相比,胰岛素释放量分别下降19%[(116.09±6.11)对(142.48±1.22)uIU/ml,t=7.336,P<0.05]及49%[(71.78±3.51)对(142.48±1.22)uIU/ml,t=13.687,P<0.05]；联合组(IL-1β2.5ng/ml+IFN-γ1000u/m1)在高糖(22.2mmoI/L)刺激下胰岛素分泌下降更明显,为(31.77±2.18)uIU/ml,较单独IL-1β(2.5ng/ml)组高糖刺激下胰岛素释放量下降65%[(31.77±2.18)对(91.01±2.62)uIU/ml,t=30.103,P<0.05],较单独IFN-γ组高糖刺激下胰岛素释放量下降55%[(31.77±2.18)对(71.78±3.51)uIU/ml,t=-50.485,P<0.05]；各组间比较,差异具有有统计学意义(F=329.098,P<0.05)。结论炎症细胞因子IL-1β、IFN-γ可抑制小鼠胰岛葡萄糖刺激下的胰岛素分泌,且二者有协同作用。第三部分小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞葡萄糖刺激下MAPK信号转导通路的活化目的探讨小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞葡萄糖刺激下MAPK信号转导通路的活化情况。方法1、NIT-1细胞培养,接种于6孔板(1×105个/孔,共6孔),48小时后换用无糖KRBH缓冲液培养0.5小时,再在含0、5.5、11.1、16.7和22.2mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育30/60分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化ERK1/2、p38及JNK的水平。2、NIT-1细胞培养,接种于6孔板(1×105个/孔,共6孔),48小时后换用无糖KRBH缓冲液培养0.5小时,再在含16.7mM/11.1mM葡萄糖的KRBH缓冲液中孵育0、5、15、30、60、120分钟,收集细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化ERKl／2、p38及JNK的水平。结果1、葡萄糖刺激后NIT-1细胞ERK1/2磷酸化水平较对照组升高,随浓度增高升高幅度越明显,在16.7mM葡萄糖刺激后ERK1/2磷酸化水平达高峰；葡萄糖刺激后NIT-1细胞p38磷酸化水平较对照组升高,随浓度增高升高幅度越明显,在11.1mM葡萄糖刺激时p38磷酸化水平达高峰,之后更高的糖浓度刺激p38磷酸化水平逐渐下降。2、最适宜的糖浓度16.7mM葡萄糖刺激15分钟后ERKl/2开始活化,随刺激时间延长活化水平升高,在30分钟时NIT-1细胞ERK1/2磷酸化水平达高峰,随着刺激时间的延长ERK1/2磷酸化水平逐渐下降；最适宜的糖浓度11.1mM葡萄糖刺激5分钟开始活化,随刺激时间延长活化水平升高,在60分钟时NIT-1细胞p38磷酸化水平达高峰,之后的120分钟p38磷酸化水平下降。3、5.5、11.1、16.7和22.2mM葡萄糖刺激后NIT-1细胞JNK磷酸化水平无升高。结论葡萄糖刺激可活化NIT-1细胞ERK1/2、p38信号转导通路,对JNK通路的活化无影响。
