辣椒防御反应相关基因的全长cDNA分离及CaERF14和CaDREB3功能分析

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植物在其生境中不可避免地遭受到高温、低温、干旱等非生物逆境及病原菌侵染和昆虫取食等生物逆境而影响其生长发育。相应地,植物通过长期的进化也形成了复杂有效的抗逆机制来减少各种逆境对其生长发育的不利影响。这些机制包括对胁迫的感知、信号转导、基因表达的调节及相应的代谢、生理和形态调节等。基因表达的调节是其中的关键环节,分离和剖析这些基因的表达和调控机制及其在植物适应逆境中的作用及其机制,对于阐明植物抗逆机制,促进植物抗逆的有效遗传改良具有十分重要的意义。辣椒(Capsicum annuum L.)是我国及世界上十分重要的茄科蔬菜和工业加工原料作物,辣椒生产具有效益高,但其土传病害多、病害和各种逆境危害严重因而风险也较高的特点,培育抗逆品种解决辣椒抗逆、确保辣椒生产的产量、品质和效益,促进辣椒可持续发展的根本技术对策,而辣椒抗逆分子机制的阐明则是实现生物技术与常规育种相结合,促进辣椒抗逆有效遗传改良的重要基础研究。鉴于此,本研究开展了辣椒AP2/ERF类转录因子、脂质转移蛋白和Arf-GAPs基因等辣椒防御反应相关基因的全长cDNA的分离,并对AP2/ERF类转录因子表达、功能进行了初步研究,主要结果如下:1、从辣椒cDNA文库中分离获得了CaERF14、CaDREB3、CaAGD8和CaLTP1等4个基因的阳性cDNA克隆,其长度分别为1572bp、1997bp、1938bp和1211bp,分别含有编码283、357、408和129个氨基酸的开放读码框。CaERF14和CaDREB3的cDNA推导的氨基酸序列都含有ERF亚族的AP2/ERF保守结构域。同源性比对及分子进化树分析表明CaERF14属于ERF亚族的Ⅹa(B-4)亚组,CaDREB3属于ERF亚族的Ⅰb(A-6)亚组,CaAGD8含有一个ARF-GAP结构域,而CaLTP1含有一个保守的AAI结构域,属于LTP家族的第Ⅰ类非特异性脂质转移蛋白。用35::CaERF14-GFP瞬间表达载体通过基因枪轰击洋葱表皮,发现35::CaERF14-GFP融合蛋白定位于细胞核和细胞膜,35:: CaDREB3-GFP融合蛋白定位于细胞核。瞬时表达结果表明CaERF14和CaDREB3都可以和GCC-box结合而不结合DRE/CRT元件。2、荧光定量分析基因表达结果表明,外源水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH)和脱落酸(ABA)及干旱、盐胁迫处理和青枯菌病原菌接种均可以诱导CaERF14上调,而不受外源生长素(auxin)、高温和低温胁迫处理诱导; CaDREB3基因在外源SA、MeJA、ETH和青枯菌病原菌接种、低温胁迫下上调,而不受外源ABA和auxin及干旱、高盐和高温等逆境胁迫诱导, CaDREB3基因在机械损伤胁迫后6h有微量的上调,其余时段都为下调表达。3、利用2个超表达转基因T1代株系的植株,研究上述两个基因超表达对表型的影响,结果发现CaERF14的超表达使转基因株系的烟草种子发芽及幼苗生长对模拟脱水逆境及盐胁迫的耐受力有所提高,表现出在上述逆境下较野生型对照高的植株鲜重、叶绿素和脯氨酸含量以及较高的SOD、POD酶活性。而青枯菌接种试验中,在CaERF14超表达转基因株系与和野生型对照中未发现明显差异。在盐胁迫下,CaDREB3超表达株系比野生型烟草表现出更高的种子发芽率、更低的植株鲜重、叶绿素含量、脯氨酸含量及SOD、CAT和POD酶活性。青枯病病原菌接种发现,CaDREB3超表达转基因烟草植株表现出较野生型对照更强的抗性。4、进一步通过荧光定量PCR分析表明, CaERF14的超表达可显著增强NtERD10a、NtERD10b、NtERD10d、NtCA、NtSOD、NtTsip1等干旱及盐相关基因的转录水平,却降低病程相关基因的转录表达水平; CaDREB3的超表达却可显著增强NtPR1、NtPR2、NtPR3、NtPR4等病程相关基因的转录水平。综上所述,经分析表明,CaERF14参与了一系列防御反应相关基因的表达,并介导了转基因烟草对高盐及干旱的抗性。ABA胁迫诱导CaERF14的表达,推定CaERF14基因可能是依赖于ABA途径应答非生物胁迫;CaDERB3参与了病程相关基因(PR)的表达,转基因CaDREB3烟草表现出对盐的敏感及抗青枯病,而ET、SA和JA对CaDREB3的诱导表达,推定CaDREB3基因可能参与了ET,或SA/JA的信号途径;生物信息学及组织特异性分析表明CaAGD8和CaLTP1可能参与应答植物生物及非生物胁迫。
摘要第8-10页
Abstract第10-12页
缩略词表第13-14页
1 前言第14-26页
    1.1 AP2/ERFs 家族第14-22页
        1.1.1 AP2/ERFs 转录因子综述第14页
        1.1.2 AP2/ERFs 转录因子的分类及亲缘关系第14-15页
        1.1.3 DREB 和 ERF 亚家族蛋白的结合特异性第15-17页
        1.1.4 AP2/ERFs 基因翻译后修饰及其互作蛋白的研究第17-18页
        1.1.5 DREB 类转录因子应答生物及非生物胁迫的功能第18-20页
        1.1.6 ERF 类转录因子应答生物及非生物胁迫的功能第20-21页
        1.1.7 其它 AP2/ERFs 亚家族基因应答胁迫功能第21-22页
    1.2 ARF-GAPs 家族第22-23页
        1.2.1 ARF-GAPs 基因综述第22页
        1.2.2 ARF-GAPs 家族基因功能第22-23页
    1.3 LTPs 家族第23-24页
        1.3.1 LTPs 基因综述第23页
        1.3.2 LTPs 家族基因功能第23-24页
    1.4 研究目的、意义和实验内容第24-26页
        1.4.1 本研究目的和意义第24-25页
        1.4.2 本研究的内容第25-26页
2 材料与方法第26-34页
    2.1 实验材料第26页
        2.1.1 植物材料及生长条件第26页
        2.1.2 菌种及载体第26页
    2.2 实验方法第26-34页
        2.2.1 基因的分离及序列分析第26-27页
        2.2.2 载体构建第27-28页
        2.2.3 瞬间表达分析第28页
        2.2.4 亚细胞定位分析第28-29页
        2.2.5 实时荧光定量 PCR 分析基因表达第29-30页
        2.2.6 烟草植物转化第30页
        2.2.7 下游胁迫相关基因的表达分析第30-32页
        2.2.8 转基因烟草逆境抗性分析及功能鉴定第32-34页
            2.2.8.1 胁迫处理第32页
            2.2.8.2 叶绿素、游离脯氨酸、抗氧化酶活性测定第32-34页
3 结果与分析第34-81页
    3.1 辣椒 CaERF14 转录因子结构和功能分析第34-55页
        3.1.1 辣椒 CaERF14 基因全长 cDNA 的分离第34-35页
        3.1.2 辣椒 CaERF14 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析第35-37页
        3.1.3 CaERF14 基因组织特异性表达分析第37-38页
        3.1.4 CaERF14 应答不同胁迫处理的表达分析第38-40页
            3.1.4.1 CaERF14 应答不同激素处理的表达分析第38-39页
            3.1.4.2 CaERF14 应答生物及非生物胁迫处理的表达分析第39-40页
        3.1.5 CaERF14 基因与 GCC-box、CRT/DRE 顺式元件结合能力分析第40-41页
        3.1.6 CaERF14 亚细胞定位分析第41-42页
        3.1.7 CaERF14 基因过量表达烟草植株的筛选、鉴定及功能和表达分析第42-47页
            3.1.7.1 转基因 CaERF14 烟草对 NaCl 胁迫应答反应第42-44页
            3.1.7.2 转基因 CaERF14 烟草对干旱胁迫应答反应第44-47页
            3.1.7.3 转基因 CaERF14 烟草对青枯菌胁迫应答反应第47页
        3.1.8 转基因 CaERF14 烟草应答非生物胁迫生理指标分析第47-50页
            3.1.8.1 转基因 CaERF14 烟草应答 NaCl 胁迫生理指标第47-49页
            3.1.8.2 转基因 CaERF14 烟草应答干旱胁迫生理指标第49-50页
        3.1.9 CaERF14 过量表达对防御反应相关基因表达量的影响第50-55页
    3.2 辣椒 CaDREB3 转录因子结构和功能分析第55-72页
        3.2.1 辣椒 CaDREB3 基因全长 cDNA 的分离第55-56页
        3.2.2 辣椒 CaDREB3 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析第56-60页
        3.2.3 CaDREB3 基因组织特异性表达分析第60页
        3.2.4 CaDREB3 应答不同胁迫处理的表达分析第60-62页
            3.2.4.1 CaDREB3 基因在各种激素处理下的表达分析第60-61页
            3.2.4.2 CaDREB3 基因在各种生物及非生物胁迫处理下的表达分析第61-62页
        3.2.5 CaDREB3 基因与 GCC-box、CRT/DRE 顺式元件结合能力分析第62-63页
        3.2.6 CaDREB3 基因亚细胞定位分析第63页
        3.2.7 CaDREB3 基因过量表达烟草植株的筛选、鉴定及功能和表达分析第63-67页
            3.2.7.1 转基因 CaDREB3 烟草对 NaCl 胁迫应答反应第64-67页
            3.2.7.2 转基因 CaDREB3 烟草对青枯菌胁迫应答反应第67页
        3.2.8 转基因 CaDREB3 烟草应答 NaCl 胁迫生理指标分析第67-69页
        3.2.9 CaDREB3 过量表达对防御反应相关基因表达量的影响第69-72页
    3.3 辣椒 CaAGD8 基因的生物信息学及组织特异性表达分析第72-76页
        3.3.1 辣椒 CaAGD8 基因全长 cDNA 的分离第72-75页
        3.3.2 辣椒 CaAGD8 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析第75页
        3.3.3 CaAGD8 基因组织特异性表达分析第75-76页
    3.4 辣椒 CaLTP1 基因的生物信息学及组织特异性表达分析第76-81页
        3.4.1 辣椒 CaLTP1 基因全长 cDNA 的分离第76-78页
        3.4.2 辣椒 CaLTP1 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析第78-79页
        3.4.3 CaLTP1 基因组织特异性表达分析第79-81页
4 讨论第81-86页
    4.1 CaERF14 基因功能及调控机制分析第81-83页
        4.1.1 CaERF14 的亚细胞定位、瞬时表达及生物学功能第81页
        4.1.2 CaERF14 基因的功能分析第81-82页
        4.1.3 CaERF14 基因调控抗干旱和抗盐机制分析第82-83页
    4.2 CaDREB3 基因功能及调控机制分析第83-85页
        4.2.1 CaDREB3 的亚细胞定位、瞬时表达及生物学功能第83页
        4.2.2 CaDREB3 基因的功能分析第83-84页
        4.2.3 CaDREB3 基因调控机制分析第84-85页
    4.3 辣椒 CaAGD8、CaLTP1 基因功能预测分析第85-86页
5 结论第86-88页
    5.1 研究进展第86页
    5.2 创新点第86页
    5.3 展望第86-88页
参考文献第88-106页
附录第106-108页
致谢第108页
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