糖尿病足患者外周血基质金属蛋白酶-2和-9表达的研究

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目的:糖尿病足(Diabetic foot,DF)难愈溃疡的基本病理改变,主要表现为溃疡处基质不能沉积,胶原蛋白过度分解,不能填充创面,角质细胞不能移行到创面,并伴有局部缺血缺氧,炎性细胞侵润,及微生物感染等,使溃疡向深和广扩大。而降解细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的主要依靠基质金属蛋白酶家族(Metalloproteinases,MMPs)的调控。已有的报道发现创面MMPs及其组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)失去正常的动态平衡,MMPs增加,TIMP下降,并发现糖尿病大血管病变患者血清中也存在MMPs/TIMP比例异常。糖尿病足溃疡创面取材困难,制约深入研究。本课题对糖尿病足患者外周血标本进行研究,探讨MMPs家族中MMP-2和MMP-9在蛋白、基因水平的变化及其机制,为临床预防和治疗糖尿病足病提供新的研究方向。方法:1随机抽取2007年3月2009年9月符合入选标准的糖尿病足患者(DF组)78例,男44例,女34例,年龄4881岁,平均64.3岁;糖尿病病程328年,平均14.6年;创面范围0.5cm×1cm13×4cm;足部溃疡病程2周5个月,平均1.9个月;111例为非糖尿病足糖尿病对照组(Dibetes without foot ulcers,NDF),男60例,女51例,年龄5279岁,平均66.2岁;糖尿病病程518年,平均13.1年;健康对照组(CON),为我院退休职工健康体检者150例,排除糖尿病、糖调节异常,无大血管病变。男79例,女71例,年龄5682岁,平均65.5岁。NDF、CON组均无足部溃疡或其他部位慢性溃疡史,近3个月内无急性外伤史,并除外心功能不全及严重肝功、肾功不全者。(1)测定三组TG、CHO、LDL-C、HDL-C、FINS、FPG、HbA1c,计算HOMA-IR,检测静脉全血白细胞计数。ELISA测定测定血清AGEs、MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度。(2)明胶酶谱法测定各组血清中MMP-2和MMP-9的活性酶表达量。(3)RT-PCR法分析三组外周静脉血白细胞MMP-2和MMP-9的mRNA表达情况。(4)两因素两水平的析因分析方法:对所有78例糖尿病足慢性溃疡患者按照TEXAs分类方法进行分期和分类。针对病因分为两类,即感染和缺血。感染性因素(A)有两个水平,有(a1)和无(a2);缺血因素(B)也是两个水平,有(b1)和无(b2)。判断不同病因对MMPs表达的影响,哪种病因为主效应,两种病因有无交互作用。具体步骤:①将2×2析因处理看做4个单因素,即甲(TEXAs分类法的D期)=a1b1,乙(B期)=a1b2,丙(C期)=a2b1,丁(A期)=a2b2。②采用完全随机设计,将符合每一个单因素的DF患者按照完全随机法进入析因分析。③每个单因素组中DF患者4例,共16例。2 1999年3月2009年9月我院内分泌科门诊及住院的新诊断的DF患者242例,所有DF均为首次发生足部溃疡。采用前瞻性研究方法,对242例入选的DF分别采用Wagner分级法和TEXAS大学分类法分类,参照美国ADA糖尿病足协助组对DF检查和危险因素的评估方法诊断下肢动脉缺血和周围神经病变,判断溃疡性质为神经性、神经缺血性、缺血性及非神经非缺血性溃疡。病情稳定出院及门诊治疗的患者每周随访一次,观察随访期为6个月,在此期间内溃疡痊愈、截肢及死亡为终点事件。结果:1 DF、NDF和CON组一般情况的比较DF、NDF和CON组的年龄、性别及民族等因素无统计学差异,吸烟史在3组之间比较未达统计意义,具有可比性;DF组并发大血管病变者为59例(患病率为75.6%),NDF组并发大血管病变者为80例(72.1%);DF组并发微血管病变者为45例(57.7%),NDF组并发微血管病变者为68例(61.3%);DF和NDF两组血管并发症(大血管及微血管并发症)发生率无统计学差异(χ2大血管=0.5466,P=0.4597;χ2微血管=0.247,P=0.6223),具有可比性;DF和NDF两组血压均高于CON组,DF与NDF之间差别无统计学意义。2生化指标的比较与对照组相比,糖尿病两组FPG、HbA1C、TG、CHO、AGEs、WBC计数、HOMA-IR、MMP-2、MMP-9均明显升高(P<0.05)。NDF组和DF组FPG、HbA1C、AGEs和TG比较差异无统计学意义(P>0.05)。全血WBC计数,三组逐渐升高:(4.35±0.47)×109/L,(6.17±0.84)×109/L,(7.62±1.13)×109/L,两两比较具有统计学意义(P<0.05);NDF组AGEs 93±10.5mg/L,DF组106.5±22.9mg/L,均高于CON 35.1±7.3mg/L;NDF组TIMP-1均值334.5μg/L虽低于CON组378.8μg/L,但差异未达到统计学意义(P>0.05),MMP-2/TIMP-1比值在两组间也无统计学差异(P>0.05);DF组MMP-2水平81.7(48.8)μg/L、MMP-2/TIMP-1比值0.3(0.1),高于NDF组[46.1(18.2)μg/L,0.1(0.1)];DF组TIMP-1水平252.5(131.6)μg/L,低于NDF组378.8(190.0)μg/L;DF组MMP-9水平624.4(485.3,994.6)μg/L高于NDF组136.1(107.4,275.1)μg/L,均具有统计学差异(P<0.05)。3 MMP-2与其他各指标的Spearman秩相关分析及回归分析Spearman秩相关显示,MMP-2血清水平与HbA1C(r=0.387)、TG(r=0.169)、AGEs(r=0.221)、病程(r=0.214)、SBP(r=0.135)呈正相关(P<0.05),与TIMP-1血清水平呈高度负相关(r=-0.852,P<0.05);与WBC计数的相关系数r=0.014,P>0.05,无统计意义。经多元线性逐步回归分析,最优回归方程为:LnMMP-2=6.264-0.591×LnTIMP-1+0.392×Ln(病程)+0.281×HbA1C+0.152×年龄。4 DF危险因素Logistic回归分析以有无DF为应变量y,病程、血管并发症、吸烟史、MMP-2/TIMP-1比值、MMP-2、FPG、HbA1C、AGEs、WBC计数、血脂、血压、和胰岛素抵抗指数等作为自变量,进行Logistic回归分析。MMP-2、大血管并发症、糖尿病微血管并发症和TG进入回归方程,是DF的独立危险因素。5 MMP-9与其他各指标的Spearman秩相关分析及回归分析MMP-9与AGEs的相关性不强,r=0.281,P<0.05;MMP-9血清水平与WBC计数呈较强正相关,r=0.776,P<0.05。LnMMP-9为应变量的回归分析,最优回归方程为:LnMMP-9=3.475+0.612×AGEs+0.435×WBC+0.281×Ln(病程)+0.041×年龄。6以高MMP-9水平为暴露因素,计算高MMP-9的糖尿病患者发生DF的相对危险度(OR值)。血清MMP-9资料属偏态分布,用百分位数法计算对照组MMP-9的上侧界值(95百分位数)为169.6μg/L,即血清MMP-9水平>169.6μg/L,定义为高MMP-9血症。采用病例对照研究资料的四格表形式计算OR值。OR=20.682,OR值的可信区间为(8.955,47.767)。(χ2=66.534)说明糖尿病患者血清MMP-9升高患糖尿病足溃疡的风险是非升高者的20倍。7明胶酶谱测定结果显示,MMP-2和MMP-9的活性在CON、NDF和DF组表现不同,MMP-2酶的比活性分别为0.4±0.0、7.0±3.3、8.2±4.5(A·mm2·g-1·L-1),糖尿病组两两比较未发现差别(P>0.05)。活性MMP-9酶的比活性逐步升高,三组分别为1.5±0.3、17.0±6.8和40.1±8.3(A·mm2·g-1·L-1),两两比较有统计学意义(P<0.05)。8前瞻性研究中242例DF中痊愈者147例(60.7%),截肢者48例(19.8%),未愈者34例(14.0%),死亡13例(5.4%)。全部愈合病例的愈合时间中位数M = 8.4周,QR = 14周。3例缺血性溃疡在观察期内采用自体骨髓干细胞移植术(2例),血管成形术(1例),在随访结束前愈合,术后愈合时间分别为7.6、10、4.8周。9 Wagner分级方法:随着分级升高,截肢率升高,分级与截肢率存在正趋势(χ2趋势= 79.6420,P < 0.001);TEXAS大学分类法:随分期升高,截肢率升高,分期与截肢率存在正趋势(χ2趋势= 32.8046,P < 0.001),分级与截肢率也存在正趋势(χ2趋势= 39.2448,P < 0.001)10比较不同病因(TEXAS大学分类法的分期)发生截肢的风险记录242例DF患者6个月内截肢发生的情况,截肢率A期1.4%、B期29.8%、C期10.8%、D期41.2%。比较缺血性溃疡(C+D期,截肢率为28.4%)与非缺血性溃疡(A+B期,截肢率16.9%)其风险增加近2倍[RR = 1.954,95%CI (1.044, 3.655)];而合并感染和缺血的溃疡(D期)较无缺血、感染的溃疡(A期)发生下肢截肢的风险增加48倍[RR = 48.300,95%CI (6.209, 375.703)]。11比较溃疡愈合时间与分级和分期的关系,经过log-rank检验仅TEXAS大学分类法的分期对溃疡愈合时间有影响(log-rank检验χ2 = 11.234,df = 3,P = 0.012)。Wagner和TEXAS大学分类法的不同分级溃疡愈合时间经检验未达到统计学意义(P值均>0.05)12 CON、NDF和DF组MMP-2、MMP-9mRNA的表达区别CON组WBC的MMP-2、MMP-9mRNA表达为0;NDF组MMP-2mRNA表达微弱为相对水平为0.07±0.01,MMP-9mRNA表达略强为0.53±0.05;DF组MMP-2mRNA表达较NDF组为高,但仍较弱0.27±0.09,两两比较达到统计学意义(P<0.05),MMP-9mRNA表达较为显著7.42±3.39,较NDF组(0.53±0.05)显著升高(F=81.485,P<0.0001)。13析因实验设计的方差分析结果感染和缺血因素对DF患者的MMP-9mRNA表达均具有影响,效应达到统计学意义。感染可使糖尿病足患者外周血WBC的MMP-9mRNA表达水平平均增加7.17,缺血可增加糖尿病足患者外周血WBC的MMP-9mRNA表达水平平均增加2.73,两者存在正协同作用。结合4个分期的MMP-9mRNA表达的均数情况,可以认为感染因素对于DF患者WBC MMP-9的mRNA表达起主要作用,缺血也有较重要的作用,两者有协同促进WBC的MMP-9表达作用。总的方差:F=96.57,P<0.0001;感染因素:F=23.41,P<0.0001;缺血因素:F=34.63,P<0.0001;交互作用:F=17.66,P=0.0012。14应用SNK-q法比较TEXAs大学分类法2级、3级、4级溃疡患者WBCMMP-9mRNA表达差异,发现此三组MMP-9mRNA表达无明显差异(两两比较P值均>0.05)结论:1糖尿病患者未发生足部溃疡前,血清MMP-2即开始升高,糖尿病足溃疡患者血清MMP-2明显升高,伴有TIMP-1水平下降,MMP-2/TIMP-1升高;MMP-2与TIMP-1高度负相关,与糖尿病病程和HbA1C正相关;MMP-2升高是糖尿病足的独立危险因素。2糖尿病患者发生DF前血清MMP-9浓度较同龄健康对照组升高1.5倍,DF血清MMP-9升高达7倍;MMP-9血清水平与WBC计数呈较强正相关;糖尿病患者血清MMP-9升高患糖尿病足溃疡的风险是非升高者的20倍。3明胶酶谱发现MMP-2和MMP-9的活性不同:糖尿病足患者血清MMP-2活性弱,而MMP-9活性相对较强。4 TEXAS大学分类法较Wagner分级法更为全面的评估糖尿病足预后,有更强的预测价值,容易分级和分期,值得在临床推广应用。5糖尿病足外周血白细胞在mRNA水平强表达MMP-9,但是MMP-2表达较弱。感染和缺血因素对DF患者的MMP-9mRNA表达均具有影响,感染因素对于DF患者WBC MMP-9的mRNA表达起主要作用,缺血有较重要的作用,两者有协同促进WBC MMP-9表达作用。足部溃疡患者外周血WBC的MMP-9mRNA表达量与溃疡深度无明显关联。
摘要第5-11页
ABSTRACT第11-17页
英文缩写第18-20页
引言第20-22页
第一部分 糖尿病足患者血清MMP-2的水平变化及与TIMP-1的相关性研究第22-37页
    前言第22-23页
    材料与方法第23-25页
    结果第25-28页
    附表第28-30页
    讨论第30-33页
    小结第33页
    参考文献第33-37页
第二部分 糖尿病足患者血清MMP-9的水平变化及与AGEs和WBC计数的相关性研究第37-49页
    前言第37-38页
    材料与方法第38-39页
    结果第39-41页
    附表第41-42页
    讨论第42-46页
    小结第46页
    参考文献第46-49页
第三部分 明胶酶谱法测定糖尿病足患者血清MMP-2、MMP-9 的活性变化第49-61页
    前言第49-50页
    材料与方法第50-53页
    结果第53-54页
    附图第54-55页
    附表第55-56页
    讨论第56-59页
    小结第59页
    参考文献第59-61页
第四部分 糖尿病足的Wagner分级方法和TEXAS大学分类法临床应用价值的比较第61-71页
    前言第61页
    材料与方法第61-63页
    结果第63-65页
    附表第65-67页
    讨论第67-68页
    小结第68-69页
    参考文献第69-71页
第五部分 糖尿病足患者外周血白细胞MMP-2、MMP-9mRNA 的表达及与糖尿病足TEXAs 大学分类法的关系第71-84页
    前言第71-72页
    材料与方法第72-75页
    结果第75-78页
    附图第78-79页
    附表第79-80页
    讨论第80-82页
    小结第82-83页
    参考文献第83-84页
结论第84-85页
综述一第85-103页
    参考文献第97-103页
综述二第103-115页
    参考文献第110-115页
致谢第115-116页
个人简历第116页
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