Bacillus Licheniformis SK13.002产具高淀粉水解活性环糊精葡萄基转移酶的生产、纯化及β-环糊精生产应用的研究

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环糊精葡萄糖基转移酶(CGTases; EC 2.4.1.19)为食品工业中重要的酶,可利用淀粉作为底物生产以α-1,4糖苷键连接的环状低聚糖——环糊精;亦可用于生产具有新特性的低聚糖。利用碱耐受菌株Bacillus licheniformis SK13.002,研究了利用不同碳源,氮源和金属离子生产热稳定的β-CGTase。不同碳源中,当使用可溶性淀粉,以及来自玉米淀粉的麦芽糊精和糊精时,可以获得最高的CGTase酶活;在CGTase产量上,这几者无明显的差别。葡萄糖和麦芽糖对CGTase的生产具有代谢物阻遏作用。有机氮源大豆蛋白胨和酵母膏对CGTase的生产极为有利;而无机氮源则不适合CGTase的生产。金属离子中,MgS04和FeCl2对CGTase的生产最为有益。其中FeCl2对发酵产酶的影响尚未见报道;仅见研究报道了FeCl2对酶的稳定性的影响。发酵培养基中添加铁离子对CGTase合成有促进作用;ZnSO4, ZnCl2和CuSO4则对CGTase生产有抑制作用。B. licheniformis SK 13.002所产CGTase可显著水解淀粉生成线形糖,此外也有环糊精(CD)生成。CGTase的水解活性是环化活性的4倍。CGTase的副反应水解反应的加强在面包烘焙工业上可能会有有利的用途,但对于环糊精的生产会有不利的影响;因为水解产生的糖在偶联反应中加速环糊精环的降解,进而会限制最后的产量。B. licheniformis SK 13.002产CGTase所具有的水解活性可看作是由于在漫长进化过程中原始酶功能的一种部分保留。因此,此CGTase是处在进化中间阶段,介于“真正的”α-淀粉酶和“真正的”环糊精葡萄糖基转移酶之间的又一例证。CGTase在pH分别为7.0和6.0时,具有最高的环化和水解活性。环化和水解的最适温度都为65℃。CGTase在两种反应中都展示了高温活性,预示其在需要高温处理环节中的潜在应用。CGTase在65℃下30 min仍保留75%的环化酶活;65℃下处理1 h还可保留65%的环化酶活;在70℃下,CGTase才失去(环化)活力。在没有经过诸如不同浓度Ca2+、底物和其他试剂的优化的情况下,已可获得很高的CGTase热稳定性。B. licheniformis SK 13.002 CGTase的这种热稳定性使得其具有在CD工业化生产中的潜力,因为在蒸煮工序之后,CGTase起作用之前,淀粉溶液冷却程度可以降低——这将会降低生产成本:亦无必要用耐热α-淀粉酶对淀粉进行预处理。酶的这种热稳定特性也为蛋白质工程提供一个具优良遗传特性的模板,依靠此模板可以创造出具期望特性,而又高度稳定的酶。B. licheniformis SK 13.002β-CGTase以5%水解淀粉为底物所产CD以p-CD为主,γ-CD为辅;产物中无α-CD。在不添加任何物质,不进行生物转化条件优化的情况下,用粗酶液转化淀粉生产CD转化率最高可达50%。24 h酶反应之后,CD产物中β-CD占83%,γ-CD为17%。酶产物中β-和γ-CDs分别为20.9 g/1和4.2g/l。在CD的生产中,经济的转化率和无有毒络合剂生成在经济上非常重要。该酶的热稳定性以及产物中CD组成(β-和γ-CDs)的特性可引起人们的兴趣,因为通过CD溶解性的差异可以经济简单地分离纯化CD产物。因此,此酶在β-CD的工业化生产上极具潜力。利用阴离子交换层析和凝胶层析将B. licheniformis SK 13.002所产CGTase纯化至电泳纯。结果显示该酶包括两个同工酶,分子量分别为67.6 kDa和47.3 kDa。通过多步的纯化,酶的比酶活从粗酶液的0.49 U/mg增加到两个酶分别为9.46U/mg和8.83 U/mg,纯化倍数为37.3,得率为19.1%。B. licheniformis SK 13.002亦为可产生CGTase同工酶的菌株。
ACKNOWLEDGEMENTS第4-5页
DEDICATION第5-6页
LIST OF FIGURES第6-7页
LIST OF TABLES第7-8页
LIST OF ABBREVIATIONS第8-9页
ABSTRACT第9-10页
摘要第11-13页
TABLE OF CONTENTS第13-17页
CHAPTER 1 INTRODUCTION AND LITERATURE REVIEW第17-32页
    1.1. GENERAL INTRODUCTION:CYCLODEXTRIN GLYCOSYLTRANSFERASEENZYMES AND CYCLODEXTRIN PRODUCTION第17-18页
    1.2. CYCLODEXTRIN GLYCOSYLTRANSFERASE ENZYMES第18-26页
        1.2.1. Starch as a Substrate for CGTase Production第18-20页
            1.2.1.1. Structure and Properties of Starch第18-19页
            1.2.1.2. Starch processing enzymes第19-20页
        1.2.2. Cyclodextrin Glycosyltransferase第20-26页
            1.2.2.1. Substrate Binding and Catalytic Properties第21页
            1.2.2.2. Three-Dimensional Structures第21-22页
            1.2.2.3. Catalytic Mechanism and Evolution of Product Specificity第22-24页
            1.2.2.4. Reaction Specificities第24-26页
    1.3. CYCLODEXTRINS(CDS)第26-30页
        1.3.1. Chemical Structure and Properties第27页
        1.3.2. Solubility of CDs第27-28页
        1.3.3. Use and Regulatory Status of CDs第28-29页
        1.3.4. CD Production第29-30页
    1.4. PROBLEM STATEMENT AND JUSTIFICATION OF RESEARCH第30-31页
        1.4.1. Problem Statement第30页
        1.4.2. Justification of Research第30-31页
    1.5. MAIN OBJECTIVE第31-32页
        1.5.1. Specific Objectives第31-32页
CHAPTER 2 EFFECT OF MEDIA COMPOSITION ON PRODUCTION AND ACTIVITY OFCGTASE FROM BACILLUS LICHENIFORMIS SK 13.002 STRAIN AND ITSAPPLICATION FOR B-CYCLODEXTRIN PRODUCTION第32-57页
    2.1. INTRODUCTION第32-34页
    2.2. MATERIALS AND METHODS第34-38页
        2.2.1. Materials第34页
        2.2.2. Bacterial Strain Cultivation Conditions for CGTase Production第34-35页
        2.2.3. Effect of Initial pH on CGTase Production第35页
        2.2.4. Effects of Media Composition on CGTase Production第35页
        2.2.5. Time Course Production of CGTase第35页
        2.2.6. CGTase Activity Assays第35-37页
            2.2.6.1. Making of a β-CD Calibration Curve第35-36页
            2.2.6.2. Cyclization Activity第36-37页
            2.2.6.3. Hydrolysis Activity第37页
            2.2.6.4. CGTase Activities as a Function of Temperature and pH第37页
        2.2.7. CGTase Thermal Stability第37页
        2.2.8. Analysis of CGTase CD Production by HPLC第37-38页
        2.2.9. Statistical Analysis第38页
    2.3. RESULTS AND DISCUSSION第38-54页
        2.3.1. Bacterial Strain Growth and Effect of Initial pH on CGTase Production第38-39页
        2.3.2. Effect of Carbon Sources on CGTase Production第39-41页
        2.3.3. Effect of Nitrogen Sources on CGTase Production第41-42页
        2.3.4. Effect of Metal Ions on CGTase Production第42-44页
        2.3.5. Time Course Production of CGTase第44-47页
        2.3.6. Effect of pH on Cyclization and Hydrolysis Activities第47-48页
        2.3.7. Effect of Temperature on Cyclization and Hydrolysis Activities第48-49页
        2.3.8. CGTase Thermal Stability第49-52页
        2.3.9. Production of CDs第52-54页
    2.4. CONCLUSIONS第54-57页
CHAPTER 3 PURIFICATION OF BACILLUS LICHENIFORMIS SK 13.002 CGTASEISOENZYMES第57-63页
    3.1. INTRODUCTION第57页
    3.2. MATERIALS AND METHODS第57-59页
        3.2.1. Materials第57页
        3.2.2. CGTase Concentration and Precipitation第57-58页
        3.2.3. Purification of CGTase第58页
            3.2.3.1. DEAE-Sepharose Ion-Exchange Chromatography第58页
            3.2.3.2. Superdex-75 Gel Filtration Chromatography第58页
        3.2.4. Molecular Weight and Protein Quantification第58-59页
    3.3. RESULTS AND DISCUSSION第59-62页
        3.3.1. Concentration and Purification of CGTase第59-61页
        3.3.2. Homogeneity and Molecular Weights of CGTase Isozymes第61-62页
    3.4. CONCLUSIONS第62-63页
4. GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS第63-66页
    4.1. GENERAL CONCLUSIONS第63-65页
    4.2. RECOMMENDATIONS第65-66页
5. LIST OF PUBLICATIONS第66-67页
6. REFERENCES第67-77页
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