我国新分离乙型脑炎病毒基因组cDNA克隆的研究

乙型脑炎病毒论文 全基因组序列特征论文 克隆载体改造论文 乙脑病毒cDNA克隆论文
论文详情
乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV),简称乙脑病毒,隶属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus).按照病毒全基因组或部分基因组序列可以将乙脑病毒分为5个基因型(基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ).JEV GZ56毒株是我国于2006年首次从病毒性脑炎患者标本中分离得到属基因I型的乙脑病毒。JEV XZ0934毒株是我国于2009年从西藏采集到的蚊子中获得的属基因V型乙脑毒株,该毒株是继马来西亚于1952年从人患中分离获得的属基因V型乙脑毒株Muar后由我国第一次分离获得的属基因V型乙脑病毒。本研究分别从两只分别因感染JEV GZ56及XZ0934而致死的乳鼠脑部中分别获得JEV GZ56及XZ0934毒株,并分别对其进行空斑纯化以期获得纯化的JEV GZ56及XZ0934毒株,进而将这两株纯化的病毒设计为16个片段扩增获得它们的全基因组序列,从而通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了这两株病毒的全基因组序列特征,以了解它们的致病性分子基础。本研究进而将JEV XZ0934毒株的基因组全长通过RT-PCR法分段扩增为两两叠搭的4个大片段,并分段克隆至具有多个限制性酶切位点的改造载体pACYC-MCS上,以期利用反向遗传学技术阐明该病毒的致病分子机理、研制重组病毒疫苗及开发基因工程载体。研究结果显示:JEV GZ56毒株的基因组全长为10965nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示JEV GZ56毒株的全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因Ⅰ型乙脑病毒(M-28株)处于同一进化分支。GZ56株与其它基因Ⅰ型乙脑病毒核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.2%-98.6%和98.2%-99.7%。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。JEV XZ0934毒株的基因组全长为10983nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示JEV XZ0934毒株的全基因组与国际上第一株从死患中分离的基因V型乙脑病毒(Muar株)处于同一进化分支。XZ0934株与GenBank中选择的23株乙脑毒株全基因组序列比较发现,其核苷酸和氨基酸总体同源性分别为78.8%-90.7%和90.0%-98.3%;其中,XZ0934株与Muar株的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7%和98.3%;与GZ56株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.4%和91.2%。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在47个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在52个氨基酸差异位点。改造载体pACYC-MCS构建成功,其全长为2467bp,具氨苄抗性且在多克隆位点(MCS)处具23个限制性内切酶;经RT-PCR扩增所得的JEV XZ0934毒株的4个大片段的长度分别为:2418bp、3002bp、2607bp、2983bp;且测序结果表明,该病毒的基因组全长已连接至改造载体pACYC-MCS上,所得pACYC-MCS-XZ0934的基因组全长为13450bp。
中文摘要第12-14页
ABSTRACT第14-15页
第一章 综述第16-22页
    1 乙型脑炎病毒的流行特征及病毒基因组全长的分子特征第16-17页
    2 乙脑病毒反向遗传系统研究状况第17-18页
        2.1 国外研究状况第17页
        2.2 国内研究状况第17-18页
    3 乙脑病毒感染性克隆构建的限制因素第18-20页
        3.1 载体选择第18-19页
        3.2 其它因素第19-20页
    4 乙脑病毒反向遗传技术的研究意义与目的第20-21页
        4.1 基础研究第20页
        4.2 载体开发第20页
        4.3 重组疫苗研发第20-21页
    5 小结第21页
    Introduction第21-22页
第二章 乙型脑炎病毒GZ56毒株的扩增纯化及全基因组序列特征研究第22-43页
    摘要第22页
    1 前言第22-23页
    2 材料与方法第23-33页
        2.1 毒株及细胞第23页
        2.2 主要试剂及工具酶第23页
        2.3 主要仪器及器材第23-24页
        2.4 实验方法第24-33页
            2.4.1 取毒JEV GZ56第24页
            2.4.2 传毒JEV GZ56第24-25页
            2.4.3 JEV GZ56毒株滴度测定第25页
            2.4.4 JEV GZ56毒株空斑纯化第25-26页
            2.4.5 JEV GZ56毒株单斑纯化第26页
            2.4.6 JEV GZ56毒株总RNA的提取第26-27页
            2.4.7 JEV GZ56毒株cDNA的合成第27页
            2.4.8 JEV GZ56毒株全基因组扩增与测序第27-31页
            2.4.9 JEV GZ56毒株全基因组序列比对、同源性分析及系统进化分析第31-33页
    3 结果第33-39页
        3.1 JEV GZ56毒株引起的细胞病变第33页
        3.2 JEV GZ56毒株的病毒滴度测定及其产生的空斑形态第33-34页
        3.3 JEV GZ56毒株16个片段的扩增第34-35页
        3.4 JEV GZ56毒株全基因组序列特征第35页
        3.5 JEV GZ56毒株全基因组序列同源性分析第35-36页
        3.6 JEV GZ56毒株E蛋白位点分析第36页
        3.7 JEV GZ56毒株全基因组序列系统进化分析第36-39页
    4 讨论第39-42页
    Abstract第42-43页
第三章 乙型脑炎病毒XZ0934毒株的扩增纯化及全基因组序列特征研究第43-59页
    摘要第43页
    1 前言第43-44页
    2 材料与方法第44-49页
        2.1 毒株及细胞第44页
        2.2 主要试剂及工具酶第44页
        2.3 主要仪器及器材第44页
        2.4 实验方法第44-49页
            2.4.1 取毒JEV XZ0934第44页
            2.4.2 传毒JEV XZ0934第44页
            2.4.3 JEV XZ0934毒株滴度测定第44-45页
            2.4.4 JEV XZ0934毒株空斑纯化第45页
            2.4.5 JEV XZ0934毒株单斑纯化第45页
            2.4.6 JEV XZ0934毒株总RNA的提取第45页
            2.4.7 JEV XZ0934毒株cDNA的合成第45页
            2.4.8 JEV XZ0934毒株全基因组扩增与测序第45-47页
            2.4.9 JEV XZ0934毒株全基因组序列比对、同源性分析及系统进化分析第47-49页
    3 结果第49-56页
        3.1 JEV XZ0934毒株引起的细胞病变第49页
        3.2 JEV XZ0934毒株的病毒滴度测定及其产生的空斑形态第49-50页
        3.3 JEV GZ56毒株16个片段的扩增第50-51页
        3.4 JEV XZ0934毒株全基因组序列特征第51页
        3.5 JEV XZ0934毒株全基因组序列同源性分析第51-52页
        3.6 JEV XZ0934毒株E蛋白位点分析第52页
        3.7 JEV XZ0934毒株全基因组序列系统进化分析第52-56页
    4 讨论第56-58页
    Abstract第58-59页
第四章 克隆载体构建及JEV XZ0934毒株基因组CDNA克隆第59-80页
    摘要第59页
    1 前言第59页
    2 材料与方法第59-70页
        2.1 主要试剂及工具酶第59-60页
        2.2 主要试剂配制第60页
        2.3 主要仪器及器材第60-61页
        2.4 实验方法第61-70页
            2.4.1 多克隆基因片段MCS的提取及双酶切第61-62页
            2.4.2 商品化质粒pACYC177的提取及双酶切第62页
            2.4.3 连接改造后的pACYC与多克隆基因片段MCS第62-63页
            2.4.4 鉴定连接载体pACYC-MCS第63-64页
            2.4.5 JEV XZ0934毒株4个大片段的扩增第64-65页
            2.4.6 双酶切载体pACYC-MCS及JEV XZ0934毒株4大片段第65-68页
            2.4.7 将JEV XZ0934毒株的基因组全长分四段连接至载体pACYC-MCS上第68-70页
    3 结果第70-76页
        3.1 多克隆基因片段MCS的设计第70页
        3.2 双酶切pACYC177及多克隆基因片段MCS第70-71页
        3.3 载体pACYC-MCS的鉴定第71页
        3.4 JEV XZ0934毒株4个大片段扩增第71-74页
        3.5 JEV XZ0934毒株全基因组连接至改造载体pACYC-MCS上第74-76页
    4. 讨论第76-79页
    Abstract第79-80页
参考文献第80-83页
在读期间发表论文目录第83-84页
致谢第84-85页
个人简况及联系方式第85-87页
论文购买
论文编号ABS549331,这篇论文共87页
会员购买按0.30元/页下载,共需支付26.1
不是会员,注册会员
会员更优惠充值送钱
直接购买按0.5元/页下载,共需要支付43.5
只需这篇论文,无需注册!
直接网上支付,方便快捷!
相关论文

点击收藏 | 在线购卡 | 站内搜索 | 网站地图
版权所有 艾博士论文 Copyright(C) All Rights Reserved
版权申明:本文摘要目录由会员***投稿,艾博士论文编辑,如作者需要删除论文目录请通过QQ告知我们,承诺24小时内删除。
联系方式: QQ:277865656