LRP16基因对胰岛β细胞功能的影响及其机制的研究

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目的:LRP16基因是我们课题组于1999年首先克隆的,定位于染色体11q12.23的基因,其表达产物是一个核蛋白。研究发现LRP16基因特异性的受雌激素受体a (ERa)的调控,并具有刺激雌激素依赖的乳腺癌细胞增殖的作用。ERа又可通过与LRP16启动子的1/2ERE/Sp1序列结合上调LRP16mRNA的表达。近年来相继报道的大型绝经期妇女雌激素替代治疗的研究得出了出人意料的结果。雌激素替代治疗不能预防心血管疾病,但却使糖尿病的发生率明显降低。表明雌激素可能具有预防糖尿病的作用。基础研究发现胰岛β细胞上表达ERа和ERβ,雌激素通过ERa调控胰岛β细胞的增殖和胰岛素分泌。因此,我们提出LRP16作为ERa的下游基因可能具有调控胰岛β细胞的胰岛素分泌的功能。本研究通过在MIN6细胞建立抑制或过表达LRP16基因的稳定细胞系,检测这些细胞的增殖,凋亡,胰岛素分泌等功能的改变,并探讨其可能机制。方法:1)建立LRP16基因抑制或过表达的MIN6稳定细胞系a)将MIN6细胞按80%密度接种于6cm培养皿中,24h后按lipofectamine2000说明书将pcDNA-3.1-16和pcDNA-3.1转染细胞,24h后更换为含800μg/ml G418的DMEM培养基进行抗性筛选3周,以后用含400μg/mlG418的DMEM培养基培养细胞,构建LRP16过表达细胞系MIN6-OE及对照细胞系MIN6-3.1。用Western Blot的方法进行检验。b)针对已经筛选确定的含有发卡结构的LRP16基因的siRNA靶序列合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与pENTR/U6载体连接产生LV-siLRP16慢病毒载体,转化至感受态细胞DH5α,挑取重组阳性菌落进行PCR及测序鉴定。将LV-siLRP16及包装系统质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,运用Q-RCR检测病毒滴度。将慢病毒颗粒感染MIN6细胞后用0.9μg/ml Blasticidin进行抗性筛选3周后半量维持培养。构建抑制LRP16表达细胞系MIN6-KO及对照细胞系MIN6-GFP。用Western Blot的方法进行检验。2) LRP16对MIN6细胞周期及增殖的影响a)流式细胞仪检测细胞周期;b) MTT法绘制细胞的增殖曲线;c) Q-PCR检测mRNA表达:cyclin Ds,cyclin E;d) Western blot检测蛋白表达:cyclin Ds,cyclin E。3) LRP16对MIN6细胞胰岛素分泌的影响a)用RIA检测胰岛素含量;b)用RIA检测不同葡萄糖浓度刺激后的胰岛素分泌;c) Q-PCR检测mRNA表达:胰岛素,GLUT2, GCK,胰岛素转录因子(PDX-1, MafA, NeuroD);d) Western blot检测蛋白表达:GLUT2, GCK,胰岛素转录因子(PDX-1,MafA, NeuroD)。4) LRP16对MIN6细胞AKT信号通路的影响a) LRP16基因对AKT信号通路的影响:细胞在5mM糖2%FBS培养条件下过夜,25mM糖刺激细胞30min, Western blot检测抑制或过表达LRP16后,对AKT及ERK1/2信号通路的影响;b)糖刺激条件下PDX-1细胞核转位:细胞在5mM糖2%FBS培养条件下过夜,25mM糖刺激细胞30min,免疫细胞化学方法检测抑制或过表达LRP16后,糖刺激条件下PDX-1细胞核转位。5) LRP16对高糖诱导MIN6细胞凋亡的影响a) Tunel检测高糖条件下的细胞凋亡:将细胞接种于放有酸处理的盖玻片的6孔培养板,同步化24h后,加入含33.3mM葡萄糖的培养液,分别孵育12h、96h,Tunel检测细胞凋亡,激光共聚焦显微镜检测。b) Western blot检测高糖条件下凋亡Marker:将细胞接种于6孔培养板,同步化24h后,加入含33.3mM葡萄糖的培养液,分别孵育12h、96h,Western blot检测抑制或过表达LRP16后,在长时间高糖条件下,胰岛β细胞凋亡Marker的改变。结果:1)建立LRP16基因抑制或过表达的MIN6稳定细胞系a)用SuperFect脂质体转染法分别把质粒pcDNA3.1-LRP16和空白质粒pcDNA3.1转入MIN6细胞中,经G418筛选,获得稳定过表达LRP16的细胞株。采用Western blot技术检测LRP16蛋白的表达情况,结果发现过表达LRP16基因细胞系(MIN6-OE)的LRP16蛋白含量约是对照组细胞系(MIN6-3.1)目的蛋白含量的2.33倍(p<0.05)。b)构建针对LRP16基因的shRNA慢病毒表达载体,该病毒转染MIN6后杀稻瘟菌素筛3周。荧光显微镜观察转染细胞显示慢病毒转染效率可达到80%-90%,Western blot检测显示抑制LRP16基因细胞系(MIN6-KO)的LRP16蛋白减少至对照组细胞系(MIN6-GFP)的56.7%(p<0.01)。2) LRP16对MIN6细胞周期及增殖的影响a)流式检测细胞周期结果显示,抑制LRP16基因细胞系(MIN6-KO)细胞S期为7.61%,较对照细胞系(MIN6-GFP) S期34.97%(p<0.05),明显减少。b) MTT结果显示,抑制LRP16基因细胞系(MIN6-KO)细胞较对照细胞系(MIN6-GFP)细胞增殖明显减缓。c) Q-PCR和westernblot结果显示在抑制LRP16基因细胞系(MIN6-KO)中cyclin Ds的mRNA和蛋白表达均较对照细胞系(MIN6-GFP)减少。3) LRP16对MIN6细胞胰岛素分泌的影响a) RIA检测胰岛素含量,结果显示,MIN6-KO胰岛素含量为207ng/105cell明显低于MIN6-GFP胰岛素含量(356.7ng/105cell)和MIN6胰岛素含量(376ng/105cell),n=3, P <0.01。b) RIA检测不同糖浓度刺激后的胰岛素分泌,结果显示,抑制LRP16基因细胞系(MIN6-KO)细胞胰岛素分泌明显低于对照MIN6-GFP和MIN6,n=3, p <0.05。c) Q-PCR检测结果显示,在抑制表达LRP16的MIN6-KO细胞中胰岛素和GLUT2的mRNAs合成,相对于对照细胞MIN6-GFP分别减少至58%(p<0.01)和2.8%(p<0.01)。在抑制表达LRP16的MIN6-KO细胞中胰岛素转录因子(PDX-1, MafA, NeuroD)的mRNA表达,相对于对照细胞MIN6-GFP分别减少至70%(p <0.05),64%(p <0.05),69%(p <0.05)。d) Western blot检测结果显示,在抑制LRP16表达的MIN6-KO细胞中GLUT2的蛋白表达,相对于对照细胞MIN6-GFP减少至58%(p <0.01),GCK的表达在两组细胞中无差别;在抑制LRP16表达的MIN6-KO细胞中胰岛素转录因子(PDX-1, MafA, NeuroD)的蛋白表达,相对于对照细胞MIN6-GFP分别减少至59.6%(p <0.05),53.8%(p <0.01),47%(p<0.01)。4) LRP16对MIN6细胞AKT信号通路的影响a)细胞在5mM糖2%FBS培养条件下过夜,25mM糖刺激细胞30min,Western blot检测抑制LRP16表达后,对AKT及ERK1/2信号通路的影响。结果显示,25mM糖刺激细胞30min后,LRP16抑制表达细胞(MIN6-KO)的p-serine-473Akt及p-ERK1/2,明显较对照细胞(MIN6-GFP)减少;LRP16过表达细胞(MIN6-OE)的p-serine-473Akt及p-ERK1/2,明显较对照细胞(MIN6-3.1)增多。b)细胞在5mM糖2%FBS培养条件下过夜,25mM糖刺激细胞30min,免疫细胞化学方法检测糖刺激条件下PDX-1细胞核转位。结果显示,在抑制LRP16表达的细胞系(MIN6-KO)中,糖刺激条件下,PDX-1细胞核转位明显较对照细胞(MIN6-GFP)减少;在过表达LRP16的细胞系(MIN6-OE)中,糖刺激条件下,PDX-1细胞核转位明显较对照细胞(MIN6-3.1)增多。5) LRP16对高糖诱导MIN6细胞凋亡的影响a) Tunel检测高糖条件下的细胞凋亡:细胞同步化24h后,加入含33.3mM葡萄糖的DMEM,分别孵育12h、96h。结果显示,33.3mM葡萄糖培养细胞96h后,细胞均出现明显的凋亡,在抑制LRP16表达的细胞系中,抑制LRP16表达细胞MIN6-KO中细胞凋亡为28±0.9%,较对照MIN6-GFP细胞凋亡23±0.1%,明显增加(p<0.05);在过表达LRP16细胞系中,过表达LRP16细胞MIN6-OE中细胞凋亡为19±0.5%,较对照MIN6-3.1细胞凋亡22±0.4%,明显减少(p<0.05)。b)高糖条件下MIN6-KO凋亡增加:细胞同步化24h后,加入含33.3mM葡萄糖的DMEM,分别孵育12h、96h, Western blot检测抑制LRP16后,胰岛β细胞凋亡Marker Bcl-2和Bax的改变。结果显示,33.3mM葡萄糖培养细胞96h后,细胞均出现Bax表达增加,Bcl-2表达减少。在抑制LRP16表达的细胞系中,抑制LRP16表达细胞MIN6-KO较对照MIN6-GFP,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少, Bax/Bcl-2比值增加,凋亡增加。c)高糖条件下MIN6-OE凋亡减少:细胞同步化24h后,加入含33.3mM葡萄糖的DMEM,分别孵育12h、96h, Western blot检测过表达LRP16后,胰岛β细胞凋亡Marker Bcl-2和Bax的改变。结果显示,33.3mM葡萄糖培养细胞96h后,细胞均出现Bax表达增加,Bcl-2表达减少;在过表达LRP16细胞系中,过表达LRP16细胞MIN6-OE较对照MIN6-3.1,Bax蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增加, Bax/Bcl-2比值减少,凋亡减少。结论:1)成功构建了过表达LRP16细胞系、抑制表达LRP16细胞系及对照细胞系,为后续实验研究提供了稳定的细胞模型。2) LRP16基因在胰岛β细胞功能中起着非常重要的作用,它可通过影响cyclin Ds的表达促进胰岛β细胞增殖。3) LRP16基因通过调控胰岛素mRNA和胰岛素转录因子促进胰岛素合成;通过影响GLUT2促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。4) LRP16基因通过影响AKT信号通路,调控PDX-1细胞核转位,从而影响胰岛β细胞功能。5) LRP16在胰岛β细胞中具有下调高糖诱导的细胞凋亡的作用。总之,LRP16基因对维持胰岛β细胞的增殖,凋亡以及胰岛素合成与分泌起着重要的作用,进一步了解LRP16的组织特异性,参与的细胞信号通路的激活和调控,将会为胰岛β细胞移植和糖尿病新的药物靶点开发及治疗提供崭新的思路和方法。
缩略词表第7-9页
中文摘要第9-15页
Abstract第15-20页
引言第21-28页
    参考文献第25-28页
第一部分 LRP16 基因抑制或过表达的 MIN6 稳定细胞系的建立第28-38页
    中文摘要第28-29页
    Abstract第29-31页
    前言第31页
    材料与方法第31-33页
    结果第33-35页
    讨论第35-36页
    结论第36页
    参考文献第36-38页
第二部分 LRP16 对 MIN6 细胞周期及增殖的影响第38-50页
    中文摘要第38-39页
    Abstract第39-40页
    前言第40页
    材料与方法第40-44页
    结果第44-47页
    讨论第47-48页
    结论第48页
    参考文献第48-50页
第三部分 LRP16 对 MIN6 细胞胰岛素分泌的影响第50-67页
    中文摘要第50-52页
    Abstract第52-54页
    前言第54页
    材料与方法第54-58页
    结果第58-62页
    讨论第62-64页
    结论第64页
    参考文献第64-67页
第四部分 LRP16 对 MIN6 细胞 AKT 信号通路的影响第67-81页
    中文摘要第67-68页
    Abstract第68-69页
    前言第69页
    材料与方法第69-71页
    结果第71-76页
    讨论第76-77页
    结论第77-78页
    参考文献第78-81页
第五部分 LRP16 对高糖诱导 MIN6 细胞凋亡的影响第81-97页
    中文摘要第81-83页
    Abstract第83-85页
    前言第85页
    材料与方法第85-87页
    结果第87-92页
    讨论第92-94页
    结论第94页
    参考文献第94-97页
全文小结第97-99页
文献综述第99-109页
    参考文献第104-109页
个人简历第109-110页
致谢第110-111页
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