基于谱效关系的黑骨藤药效物质辨识研究

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黑骨藤为萝摩科(Asclepiasaceae)杠柳属(Periploca)植物黑龙骨(Periploca forrestii Schltr.)的根及根茎,大部分生长于阴暗潮湿之处,或者有水源的峭壁之上;主要分布于我国西部及南部地区如贵州、广西、四川、青海、西藏等地。黑骨藤全株入药,具有通经、活血、解毒、祛风的功效,民间广泛应用于治疗闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病。中药有效物质的辨识一直是中药现代化研究中的重点和难点。为了寻求一种黑骨藤药效物质辨识的方法,本论文在国家自然基金的资助下,于课题组前期对黑骨藤80%乙醇提取部位指纹图谱及谱效关系探索性研究的基础上,开展了相关药效物质辨识研究:通过对分离材料的筛选,优选出大孔树脂为分离材料,对黑骨藤80%乙醇提取部位组分群进行分离制备;并对分离得到的各个组分群进行体外抗过敏、体外抗氧化、乙酰胆碱酯酶抑制活性、细胞毒性等药效学优选研究,从而选出活性较强的组分;然后采用紫外吸收光谱和高效液相色谱法对其进行药效物质辨识研究,结果显示,组分中主要成分为黄酮类化合物;基于药效物质辨识的结果,以黑骨藤总黄酮提取率为指标进行超声预处理微波提取工艺研究,优化提取工艺条件,并进一步对其进行体外抗过敏活性验证。通过上述研究,为黑骨藤及其制剂的深度开发利用和质量控制提供了科学依据和理论基础。主要结果如下:1.黑骨藤有效成分群的分离与富集此部分研究对黑骨藤80%乙醇提取液进行了分离制备:通过预实验得到大孔树脂为最佳分离材料,并对溶剂洗脱系统进行了优化:采用5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%至95%乙醇分段洗脱,通过高效液相色谱法检测洗脱液出峰情况,对其进行调整,合并收集相同组分,历时6个月,分离富集了6段黑骨藤组分群A(18 g)、B(8 g)、C(5 g)、D(10 g)、E(10 g)、F(10 g)。根据组分群的高效液相色谱图,与黑骨藤80%乙醇提取部位指纹图谱进行归属分析:指纹图谱上标记了8个特征峰,其归属关系为A(1、2)B(3)C(4、5)D(6)E(7、8)F(30-35 min成分群)。这为下一步组分群的药效研究奠定了基础。2.黑骨藤各组分群的药效学优选研究此部分研究中,以上述富集的黑骨藤80%乙醇提取部位组分群为基础,结合黑骨藤传统药效和现代化药理活性研究进展,选择抗氧化活性(ABTS·+自由基清除能力、DPPH·自由基清除能力)、乙酰胆碱酯酶抑制活性、抗过敏活性、细胞毒性对其进行药效学优选研究。结果显示:ABTS·+自由基清除能力大小:E>D>B>C>A>F>G;DPPH·自由基清除能力大小:E>F>D>C>A>B>G;乙酰胆碱酯酶抑制活性大小:E>D>F>B>A>C>G;体外抗过敏活性大小为E>A>C>F>B>D>G;对MH7A类风湿关节炎细胞毒性大小为E>A>B>C>D>G>F。课题组前期通过谱效关系研究推测的抗炎有效物质峰为2、6、8号,包含于A(1、2)、D(6)E(7、8)中,在此部分试验中,证实了2、8号峰位于的A、E段拥有较好的活性;在体外抗氧化与体外乙酰胆碱酯酶抑制活性中,E段的活性都为最强,因此,E段组分群可作为后续药效物质辨识研究的对象。3.黑骨藤E段组分群药效物质辨识研究此部分研究以活性最优的E段组分群为对象,采用紫外吸收光谱法和高效液相色谱法对其进行药效物质辨识研究。E段高效液相色谱图中主要有5个特征峰,通过样品与对照品紫外吸收波长和高效液相色谱图保留时间对比,指认了两个黄酮类化合物,分别是槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。4.黑骨藤总黄酮提取工艺研究前述药效学优选出来活性最佳的E段组分群中含有黄酮类化合物,这为黑骨藤的进一步开发利用提供了科学参考。本项研究中,采用超声预处理微波提取技术,通过单因素实验筛选出超声预处理最佳时间25 min,运用中心组合(BBD)响应面法,以黑骨藤总黄酮提取率为指标优化提取工艺参数:微波功率(W)、乙醇浓度(%)、液料比(m L·g-1)及微波时间(s),通过实验得到最佳提取工艺参数为:乙醇浓度59.92%、液料比21.24 m L·g-1、微波时间为209.53 s、微波功率274.14 W。在此工艺参数下,黑骨藤总黄酮提取率为9.11±0.08%,与微波提取法相比增加了14.30%,与超声波提取法相比增加了19.86%;通过聚酰胺纯化后,超声预处理微波提取的黑骨藤总黄酮的抗过敏活性半抑制率为IC50=1.033 mg·m L-1,分别优于超声提取法(IC50=12.913 mg·m L-1)与微波提取法(IC50=1.762 mg·m L-1)。
本文主要缩写符号说明第8-9页
本文主要仪器说明第9-10页
摘要第10-13页
ABSTRACT第13-16页
序言第17-19页
第一章 文献综述第19-26页
    1.1 黑骨藤概述第19页
    1.2 黑骨藤研究进展第19-22页
        1.2.1 黑骨藤化学成分研究进展第19-21页
        1.2.2 黑骨藤药理作用研究进展第21-22页
    1.3 中药药效物质辨识方法研究进展第22-25页
        1.3.1 药理活性法第22-23页
        1.3.2 代谢组学与血清药物化学法第23-24页
        1.3.3 基于谱效关系的中药药效物质辨识法第24页
        1.3.4 其他方法第24-25页
    1.4 小结第25-26页
第二章 黑骨藤组分群的分离与富集第26-31页
    2.1 课题组前期工作介绍第26-27页
    2.2 实验仪器与试剂第27页
        2.2.1 实验仪器第27页
        2.2.2 实验材料与试剂第27页
    2.3 实验方法第27-29页
        2.3.1 大孔树脂预处理与回收利用第27-28页
        2.3.2 样品制备第28页
        2.3.3 样品分段制备第28页
        2.3.4 样品HPLC-DAD分析第28-29页
    2.4 结果与讨论第29页
        2.4.1 样品分段制备第29页
        2.4.2 样品HPLC-DAD分析第29页
    2.5 小结第29-31页
第三章 黑骨藤各组分群药效学优选研究第31-48页
    2.1 体外抗过敏活性研究第31-34页
        2.1.1 活性选择理由第31页
        2.1.2 实验仪器与试剂第31-32页
        2.1.3 主要试剂配制第32页
        2.1.4 实验方法第32-33页
        2.1.5 统计分析第33页
        2.1.6 结果与讨论第33页
        2.1.7 小结第33-34页
    2.2 MH7A类风湿关节炎细胞毒性研究第34-40页
        2.2.1 活性选择理由第34页
        2.2.2 实验仪器与试剂第34-35页
        2.2.3 主要试剂配制第35页
        2.2.4 实验方法第35-36页
        2.2.5 细胞毒性实验第36页
        2.2.6 细胞形态学观察第36-37页
        2.2.7 统计分析第37页
        2.2.8 结果与讨论第37-38页
        2.2.9 小结第38-40页
    2.3 体外抗氧化活性研究第40-43页
        2.3.1 活性选择理由第40页
        2.3.2 实验仪器与试剂第40页
        2.3.3 主要试剂配制第40-41页
        2.3.4 实验方法第41页
        2.3.5 统计分析第41-42页
        2.3.6 结果与讨论第42-43页
        2.3.7 小结第43页
    2.4 乙酰胆碱酯酶抑制活性研究第43-46页
        2.4.1 活性选择理由第43-44页
        2.4.2 实验仪器与试剂第44页
        2.4.3 主要试剂配制第44-45页
        2.4.4 实验方法第45页
        2.4.5 统计分析第45页
        2.4.6 结果与讨论第45-46页
        2.4.7 小结第46页
    2.5 总结第46-48页
第四章 黑骨藤E段组分群药效物质辨识研究第48-52页
    4.1 实验仪器与试剂第48-49页
        4.1.1 实验仪器第48页
        4.1.2 实验试剂第48页
        4.1.3 主要试剂配制第48-49页
    4.2 实验方法第49页
        4.2.1 黑骨藤E段组分群高效液相色谱分析第49页
        4.2.2 对照品高效液相色谱分析第49页
    4.3 结果与讨论第49-51页
        4.3.1 黑骨藤E段组分群高效液相色谱图研究第49-50页
        4.3.2 黑骨藤E段组分群与对照品紫外吸收光谱图对比研究第50-51页
        4.3.3 黑骨藤E段组分群与对照品高效液相色谱图对比研究第51页
    4.4 小结第51-52页
第五章 黑骨藤总黄酮提取工艺研究第52-68页
    5.1 实验仪器与试剂第53页
        5.1.1 实验仪器第53页
        5.1.2 实验材料与试剂第53页
    5.2 实验方法第53-57页
        5.2.1 黑骨藤总黄酮含量测定方法第53-55页
        5.2.2 超声波预处理微波提取黑骨藤总黄酮工艺流程第55页
        5.2.3 单因素实验设计第55-56页
        5.2.4 黑骨藤总黄酮提取工艺的响应面设计实验第56-57页
        5.2.5 验证试验第57页
        5.2.6 聚酰胺纯化黑骨藤总黄酮第57页
        5.2.7 体外抗过敏活性的测定第57页
    5.3 统计方法第57页
    5.4 结果与讨论第57-67页
        5.4.1 最大吸收波长的确定第57-58页
        5.4.2 超声预处理时间对黑骨藤总黄酮提取率的影响第58页
        5.4.3 乙醇浓度对黑骨藤总黄酮提取率的影响第58-59页
        5.4.4 液料比对黑骨藤总黄酮提取率的影响第59页
        5.4.5 微波时间对黑骨藤总黄酮提取率的影响第59-60页
        5.4.6 微波功率对黑骨藤总黄酮提取率的影响第60页
        5.4.7 黑骨藤总黄酮提取工艺参数的优化第60-65页
        5.4.8 验证试验第65-66页
        5.4.9 提取工艺比较第66页
        5.4.10 体外抗过敏活性的测定第66-67页
    5.5 小结第67-68页
第六章 结论与展望第68-70页
    6.1 实验结论第68-69页
    6.2 创新点第69页
    6.3 展望第69-70页
参考文献第70-76页
附录第76-77页
致谢第77-78页
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