T9代“玉米稻”中玉米DNA侧翼序列的鉴定与克隆

本实验室通过远缘分子杂交技术将玉米DNA导入水稻，获得了大量的水稻变异材料，经过多代自交筛选，得到一批具有与供体玉米性状相似、能稳定遗传的水稻变异株系。本研究选取稳定遗传至第九代的水稻变异株系131-5-2作为研究材料，鉴定和克隆玉米DNA片段，旨在为远缘分子杂交育种技术介导玉米DNA创造水稻新种质提供理论数据。本实验室用AFLP技术在T7代水稻变异株系131-5-2中获得一条长为349bp的玉米DNA片段（P5M3-131-349），本研究采用巢式PCR方法在T9代变异株系131-5-2中对该序列进行验证。结果显示，在T9代变异株系131-5-2中扩增出一条212bp的目的片段。经BALST分析，该片段与在阳性对照玉米中扩增出的目的带匹配率为100%；与P5M3-131-349序列的匹配率为99.54%，仅有一个碱基的差异。说明在T9代变异株系131-5-2中仍然存在P5M3-131-349序列，该序列已完全整合到变异株系基因组中并能稳定遗传。经MaizeGDB数据库中的Blast工具比对，P5M3-131-349序列位于玉米第10号染色体上。根据MaizeGDB数据库中公布的玉米第10号染色体碱基序列，设计一对引物HF/HR，以基因组DNA为模版，对P5M3-131-349序列进行3’端侧翼序列扩增，在阳性对照玉米和T9代变异株系131-5-2中均扩增到一条长为541bp的目的条带（在阴性对照水稻中没有扩增出目的带），经BALST分析，T9代变异株系131-5-2中扩增出的目的条带（P5M3-349-541）与阳性对照玉米中扩增出的目的带的核苷酸同源性为100%。P5M3-349-541和P5M3-131-349序列经DNAStar软件拼接后得到一条长为597bp的DNA片段(P5M3-349-597)。在NCBI数据库中，对P5M3-349-597序列进行Blastn序列检索。结果显示，该序列与GeneBank登录号为EU963081.1的玉米mRNA具有100%的核苷酸同源性，并且该序列位于EU963081.1的第260-856位碱基之间。EU963081.1翻译的蛋白质为半胱氨酸型内肽酶/泛素硫酯酶。这进一步证明水稻变异株系基因组中整合有玉米DNA片段，并且具有编码蛋白质的功能。半胱氨酸型内肽酶/泛素硫酯酶蛋白含有495个氨基酸残基。蛋白质结构预测显示，该蛋白质二级结构主要以无规则卷曲为主，具有2次跨膜疏水区，主要位于质膜、叶绿体体膜、高尔基体、内质网等膜上，其在叶绿体膜上的可能性最大。水稻变异株系131-5-2表现出的气生根、紫茎、紫叶缘，紫叶鞘等性状是否与该蛋白有关有待进一步研究。