褪黑素melatonin(5-methoxy-N-acetyltryptamine),是一种广泛存在的小分子吲哚胺类物质,从单细胞藻类到灵长类动物都有存在。在哺乳动物体内是一种主要由松果体合成分泌的神经内分泌激素,是存在于从藻类到人类等众多生物中的一种荷尔蒙,它在生物体内的含量水平随每天的时间变化而变化。褪黑素的分泌受昼夜节律性的调节,分泌高峰主要出现在夜晚,而白天分泌减少。调节褪黑素分泌昼夜节律性的主要中枢位于下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nuclei, SCN),主要通过多突触连接来调节松果体的功能。由于褪黑素是一种脂溶性激素,所以它不但可以通过血脑屏障,而且可以通过下丘脑屏障直达中枢神经系统发挥效应,尤其在各种脑损伤中,褪黑素更是通过损伤的血脑屏障直达中枢神经系统发挥效应。在人体内可参与调节多个系统的功能。最近的研究发现,褪黑素受体在不同发育程度的大鼠胚胎中枢神经系统的多个区域均有表达,且在小鼠NSCs,神经元和胶质细胞上都有褪黑素受体(melatonin receptor)的表达。这些研究结果表明褪黑素可能参与调节了神经系统的发育。氧是细胞能量代谢的重要底物,是细胞新陈代谢的重要调控环节,机体一系列的病理状态均伴随缺氧的发生,其中脑组织对氧的需求量大,而储存量又很少,所以中枢神经系统对缺氧最为敏感,耐受性低。缺氧会影响干细胞生存的微环境状态,虽暂时性促进NSCs增殖,却最终抑制了NSCs的增殖,使其增殖数量减少,且使其分化不良。NSCs是指神经系统中具有干细胞特征的细胞群体,能自我更新和分化,可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞等细胞群,用于各种脑损伤和退行性病变的治疗。但是,褪黑素对缺氧损伤的神经干细胞有没有作用,有什么样的作用,以及其可能的机制是什么,至今尚未见报道。因此,我们利用NSCs体外缺氧模型来模拟脑缺氧环境,采用MTT,免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术方法,研究褪黑素对体外缺氧NSCs的作用及其可能发挥作用的作用机制。一、NSCs的分离、培养和扩增NSCs体外培养成功与否取决于动物种属、年龄、取材部位、接种密度、培养基营养条件及促有丝分裂因子的选择等。研究发现,相比于新生鼠和成年鼠,胚胎鼠脑皮质中NSCs含量最高,且胚胎来源的NSCs体外分离培养时具有更高的扩增能力和分化潜能。其中胎龄12-15天的胚胎中NSCs的增值分化潜能处于高峰。实验选用了孕12.5天的小鼠胚胎体外分离培养NSCs,在体视镜下分离胚胎神经管前端脑泡,经机械吹打获取细胞悬液,接种于无血清的神经干细胞培养基,获得神经前体细胞(neuralprogenitor cells, NPCs),应用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记以及巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色技术检测其增殖和更新能力,采用神经元特异性抗体微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2, MAP2)和神经胶质细胞特异性抗体胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫荧光染色法检测了其分化情况。实验显示,获得的是具有增殖能力和分化潜能的神经前体细胞,可以用于后续实验研究。实验结果显示,我们体外分离培养的神经干细胞具有较好的增值能力和自然分化能力,完全可以用于后续的实验研究。二、褪黑素对体外缺氧NSCs增殖分化的影响为了研究不同浓度褪黑素对NSCs细胞活性的影响,我们用MTT法检测细胞活性来筛选了最佳的药物浓度,实验设置0,1 nm,10 nm,100 nm, 1μm, 10μm,100μm七个浓度梯度,结果显示,特定浓度的褪黑素可提高NSCs的细胞活性,而且该作用呈现一定的剂量依赖关系,当褪黑素的浓度达到100nM时,细胞的活性最高,所以我们选用100nM的褪黑素浓度作为后续实验的药物浓度。体外模拟脑缺氧模型,体外培养的NSCs体外缺氧12h作为模拟脑缺氧的体外模型,利用MTT检测了缺氧后NSCs的细胞活性,结果显示体外缺氧后NSCs细胞活性明显降低,说明神经干细胞体外缺氧模型是成功的。我们把实验分为四个组,正常对照组(CT),正常加药组(CT+MT),缺氧组(Hy),缺氧加药组(Hy+MT).各个对照组和处理组之间均存在显著性差异,说明褪黑素可显著提高细胞的细胞活性。且褪黑素对神经干细胞的增殖的促进作用在缺氧后的第3天最明显。后我们又通过BrdU掺入实验来检测褪黑素对体外缺氧神经干细胞增殖作用的影响,缺氧后四组细胞分别在缺氧后第3天检测细胞增殖,BrdU免疫荧光染色结果显示干细胞的增殖高峰在第3天。对于NSCs体外缺氧处理后,分成上述四组进行体外诱导分化实验,分别在分化的第3,5,7,9天进行GFAP和MAP2的免疫荧光染色标记分化的细胞,染色后计数阳性细胞数,并进行统计学分析,结果显示缺氧明显抑制了NSCs向神经元方向的分化,而褪黑素则有效补救了这一后果,明显促进了NSCs向神经元方向的分化。褪黑素对向星形胶质细胞的分化没有明显变化,但却可以明显促进向少突胶质细胞的分化,使胶质细胞的分化明显提前。三、褪黑素影响体外缺氧NSCs增殖分化的机制研究为了研究褪黑素促进NSCs增殖的机制,我们检测了NSCs表面的受体表达情况,分别从基因和蛋白的水平上检测到了褪黑素I型受体的表达。而MAPK信号通路是褪黑素作用与神经系统的重要信号通路,MAPK又是调节细胞增殖分化的主要信号通路。我们再加入褪黑素处理后的5、15、30、60和75 min四个时间点收集NSCs,通过Western blot检测了ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达状况。结果显示,ERK1/2可被褪黑素所激活,而活化型ERK1/2即p-ERK1/2的水平在5min开始升高,至30 min到达到高峰,之后开始下降,至75 min接近正常水平,而细胞内总的ERK1/2的水平则没有明显变化。加入褪黑素受体的抑制剂(Luzindole)后,p-ERK1/2的活化水平和细胞的增殖率均明显低于单纯褪黑素作用组,而和对照组水平接近。这表明,褪黑素确可通过与NSCs表面的褪黑素受体结合,通过诱导ERK1/2的快速磷酸化,调节细胞的增殖。提示ERK1/2的活化参与了褪黑素对体外缺氧NSCs增殖的促进作用。为了研究褪黑素对体外缺氧NSCs分化的可能机制,我们应用RT-PCR方法检测了与NSCs分化密切相关的bHLH家族主要转录因子的表达变化,结果显示,Neurog1、NeuroD2、Mash1、Id1和Hes5的mRNA水平与对照组相比均有显著升高。其中Neurog1、NeuroD2、Mash1和Idl四个转录因子不仅mRNA水平高于对照,并且在褪黑素处理组的峰值均比对照组提前出现。四、褪黑素对体外缺氧NSCs凋亡的影响机制研究以往的研究显示,褪黑素有神经保护作用,但其分子机制不明。本研究采用体外缺氧的方法,建立稳定的体外缺氧模型。结果显示,褪黑素治疗组同对照组相比细胞凋亡的数量明显降低,与以往的研究结果相一致。为了探讨褪黑素抑制细胞凋亡的机制,我们检测了Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表达水平,结果显示,褪黑素处理组活化型caspase-3和Bax的表达水平明显低于体外缺氧处理组,Bcl-2蛋白则明显升高,提示Caspase3、Bax和Bcl-2共同参与了褪黑素对体外缺氧后NSCs的抗凋亡作用。结论：褪黑素能促进体外缺氧的NSCs的细胞活性,并表现出一定的剂量依赖性。褪黑素能促进体外缺氧的NSCs的增殖,并上调ERK1/2的蛋白磷酸化。褪黑素能调节NSCs分化相关基因的表达,促进神经元和少突胶质细胞的分化,但对向星形胶质细胞的的分化却并没有影响。另外褪黑素还能通过调节凋亡相关蛋白的表达减少NSCs的凋亡。
