(木奈)均一化全长cDNA文库的构建及果实褐变相关基因的分离与表达分析

(木奈)(PrunussalicinaLindli.varcordataJ.Y.Zhangetal.
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(木奈)(Prunus salicina Lindli. var cordata J.Y.Zhang et al.)属蔷薇科(Rosaceae),李属(Prunus),是原产福建的名、特、优水果之一,果桃形李实,酸甜适度,风味极佳,是南方的一种重要水果。但在果实采收以及贮藏期间,发现了果实褐变现象。发生褐变的(木奈)果果实,虽然外观表现正常,但是果肉已经发生褐变,以果腔附近的果肉褐变尤为严重,这种果肉褐变在采前和采后贮藏过程中均会发生,导致果实的食用品质和耐贮藏性下降,甚至丧失其商品价值,严重影响(木奈)果的市场声誉,给生产带来极大的经济损失。因此,(木奈)果肉褐变问题成为制约(木奈)果产业发展的瓶颈。本研究以油(木奈)褐变初期的果肉为试材,应用SMART(Switching Mechanism At5′end of the RNA Transcript)建库技术和DSN(Duplex-Specific Nuclease)均一化处理相结合的方法,构建了油(木奈)褐变果实均一化全长cDNA文库,进行了大规模的5′EST测序,并进行基因功能注释,根据所有EST基因的功能预测和前人对果实褐变的研究进展及结果,选取了6个可能与(木奈)果实褐变相关的基因,编号为:NFH-102、NFH-C23、NFH-F21、NFH-17、NFH-633、NFH-99,并对这些基因进行了生物信息学分析,采用染色体步移技术分离这些基因的启动子,并对启动子序列进行分析,同时,采用Real-time PCR技术分析了这些基因在(木奈)果实采后各种生物和非生物胁迫下的表达模式,根据这些研究结果,可以初步推测,(木奈)果实褐变过程是一个复杂的基因调控网络。主要研究结果如下:1.应用SMART建库技术和DSN均一化处理相结合的方法,构建了油(木奈)果实褐变初期的均一化全长cDNA文库,经检测,该文库的初始滴度为2.0×106pfu/ml,重组率为99%,插入片段平均大小为1.8kb,文库质量良好。随机挑取720个阳性克隆进行5′EST测序,经序列拼接、去掉污染序列,突变移码序列后,共获得684条有效的ESTs(Expressed SequenceTags)序列,对该684条有效序列进行拼接后,58条被组装成21个重叠群(contigs),单拷贝(singlets)基因有626条,共得到647个单基因簇,文库冗余率为8.4%。用Blast2go在线软件对其测序结果进行注释和归类分析,已知功能基因与能量代谢、蛋白质合成与降解、次生代谢物质、细胞壁代谢和转录因子有关。2.根据候选基因的功能预测以及前人对果实褐变的研究结果,本研究选取6个可能与(木奈)果实褐变相关的基因(苯丙氨酸解氨酶基因、膨胀素1,2,3基因、NAC和WRKY类转录因子),分别从基因生物信息学分析、启动子分离以及(木奈)果实在采后生物和非生物胁迫下的表达模式进行了研究。具体结果如下:(1)本试验分离的苯丙氨酸解氨酶,全长2497bp,包含2154bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,蛋白质分子量为78kDa,理论等电点为6.6,包含119bp的5′UTR和224bp的3′UTR。系统进化树分析表明,与蔷薇科樱桃属于同一簇,具有苯丙氨酸解氨酶-组氨酸解氨酶(PAL-HAL)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)保守区域。在各种胁迫和乙烯处理条件下,与对照相比,PsPAL在转录水平上呈现不同程度的差异表达。在响应机械损伤和低温处理后,PsPAL呈明显的上调表达趋势;高温和无氧处理后该基因呈先上升后下降的趋势;乙烯处理后,PsPAL呈上调-下调-上调的趋势。(2)本研究从均一化全长cDNA文库中分离得到3个膨胀素基因,分别命名为PsEXP1、PsEXP2和PsEXP3,基因登录号分别为:JN675711, JN675712和JN675713。A:3个基因分别长1303bp,1392bp和1384bp,开放阅读框为759bp,780bp和759bp,编码253到260个氨基酸,其分子量为26.76kDa,27.99kDa和26.80kDa,理论等电点为7.3,9.5和9.2;B:同源性比对分析表明,共含有8个保守的半胱氨酸残基和4个色氨酸残基,并含有一个保守的HFD域,这个区域可能是45-家族内葡糖基酶的一个催化位点;系统进化树分析表明,PsEXP1,PsEXP2和PsEXP3分别落入α-膨胀素不同的亚家族,PsEXP1包含在B亚族,PsEXP2包含在A亚族,PsEXP3包含在C亚族,不同的亚族具有不同的生物功能;对3个基因进行基因组DNA序列扩增表明,都含有3个外显子和2个内含子;C:分别获得PsEXP1,PsEXP2和PsEXP3上游899bp,744bp和596bp的调控序列,均含有启动子的典型结构特征,如TATA-box,CAAT-box等,同时都包含有厌氧诱导元件、胚乳表达元件和光反应元件;D:对3个膨胀素基因在其果实发育的不同时期以及果实采后各种胁迫处理下的表达模式分析,结果表明,除了PsEXP1在花后1周即果实刚发育时期没有表达外,3个基因在(木奈)果整个生长发育期都有表达;3个基因的表达模式分为3种:(a):PsEXP1基因的表达呈下调-上调的表达模式;(b):PsEXP2基因的表达呈上调-下调-上调的表达模式;(c):PsEXP3基因的表达呈上调-下调的表达模式;E:3个基因在(木奈)果实采收各种胁迫下的表达模式,3个基因受乙烯和损伤的诱导表达,不受高、低温以及无氧的诱导。(3)经均一化全长cDNA文库5′EST测序,发现编号为NFH-633的序列与苹果的MdNAC基因同源性很高,我们将其命名为PsNAC,基因登录号为:JN675710。其序列包含1077bp的开放阅读框,编码359个氨基酸,蛋白质分子量为39kDa,理论等电点为9.14。用半定量分析表明,该基因在(木奈)褐变果实中表达而在正常果实中未表达。与苹果、杨树、脐橙的NAC基因的氨基酸序列同源性均有超过60%的同源性;蛋白结构域分析表明,PsNAC基因编码的氨基酸序列N末端含有可能包含DNA结合域的NAC类转录因子的保守序列(NA-D);同源进化树分析PsNAC属于NAC家族的NAP亚类,NAP亚类的基因大多数与植物的衰老有关;酵母试验研究表明,该基因在C末端具有转录激活活性;通过亚细胞定位分析该基因定位于细胞核中;在(木奈) PsNAC基因的5′上游获得825bp的调控序列,这些序列经在线软件PlantCARE进行分析,都含有启动子的典型的结构特征,如TATA-box,CAAT-box等,还含有厌氧诱导元件、与干旱诱导相关的元件(MYB元件,TAACTG)、低温相关的元件(LTR core element,CCGAAA),全部的这些元件可能与胁迫和逆境相关;Real-time PCR检测PsNAC基因在机械损伤、乙烯、无氧处理下呈上调表达;而在高温处理下呈下调表达;在低温处理下无明显变化,特别是在乙烯诱导下,PsNAC基因表达量明显增强。(4)WRKY类转录因子是从文库中筛选到的另一个转录因子,将其命名为PsWRKY基因,登录号为:JN675708。其序列长1836bp,包含1599bp的开放阅读框,编码533个氨基酸,蛋白质分子量为58kDa,理论等电点为8.3。用半定量分析表明,该基因在(木奈)褐变果实中的表达量比正常果实中高。该基因编码的氨基酸序列具有WRKY家族的特征,含有两个WRKY保守结构域,两个C2-HC型(C-X4-C-X22-H-X1-H)和(C-X4-C-X23-H-X1-H)锌指结构域和一个预测核定位信号PKRR。酵母试验研究表明,PsWRKY具有转录激活活性;通过亚细胞定位分析该基因定位于细胞核中;在PsWRKY基因的5′上游获得916bp的调控序列,这些序列经在线软件PlantCARE进行分析,都含有启动子的典型的结构特征,如TATA-box,CAAT-box等,激素响应元件(茉莉酸甲酯)以及抗病相关的元件(W-Box);Real-time PCR检测PsWRKY基因在机械损伤和高温处理下呈下调表达,在乙烯、无氧、低温处理下呈上调表达。3.从(木奈)成熟叶片均一化全长cDNA文库中新分离得到了一个PPO基因,命名为PsPPO2,基因登录号为:JF681036.1。经NCBI-BLAST分析,其核苷酸序列与蔷薇科果树中的河北鸭梨和富士苹果果实的PPO基因具有很高的同源性,分别为81%和80%;与作者先前分离克隆的PsPPO1和PsPPO3基因同源性分别为55%和56%,说明此克隆是PPO基因家族的新成员。通过RT-PCR分析,PsPPO1,PsPPO2和PsPPO这3个基因在(木奈)不同生长发育时期和果实受损伤后的表达模式。在叶片发育过程中,PsPPO2表达量都很高;PsPPO1在嫩芽和幼叶中表达;PsPPO3只在嫩芽中表达;在果实发育的不同时期,PsPPO2和PsPPO3在早期表达,随着果实成熟表达量下降,PsPPO1在褐变果中表达量较高。受机械损伤后,PsPPO1受诱导,而PsPPO2和PsPPO3不受诱导。
摘要第10-14页
Abstract第14-17页
缩略词第18-19页
第一章 文献综述第19-30页
    1 木奈果实褐变机制的研究进展第19-20页
        1.1 木奈果实褐变症状及定义第19-20页
        1.2 木奈果实褐变生理及分子研究进展第20页
    2 农产品酶促褐变机制的研究进展第20-23页
        2.1 褐变发生的条件第20-22页
            2.1.1 底物(酚类物质)第20-21页
            2.1.2 果实褐变发生的相关酶类第21-22页
            2.1.3 氧第22页
        2.2 农产品酶促褐变的基因调控研究进展第22-23页
    3 影响果实酶促褐变的因素第23-27页
        3.1 采前因素第23-24页
            3.1.1 果实大小与成熟度第24页
            3.1.2 栽植条件与树体营养第24页
        3.2 采后因素第24-27页
            3.2.1 机械损伤第24-25页
            3.2.2 冷害第25页
            3.2.3 气体伤害第25-26页
            3.2.4 乙烯第26-27页
            3.2.5 光线第27页
    4 本研究采用的均一化全长 cDNA 文库构建策略第27-29页
        4.1 均一化全长 cDNA 文库构建的技术流程第27-28页
        4.2 均一化全长 cDNA 文库在分离植物基因中的应用第28-29页
    5 本试验研究目的及意义第29-30页
第二章 木奈褐变果实均一化全长 cDNA 文库的构建及随机 EST 序列初步分析第30-40页
    1 材料与方法第30-32页
        1.1 植物材料与主要试剂第30页
        1.2 方法第30-32页
            1.2.1 木奈褐变果肉总 RNA 的提取第30页
            1.2.2 cDNA 第一链合成和 LD-PCR 扩增第30-31页
            1.2.3 cDNA 进行均一化处理第31页
            1.2.4 均一化全长 cDNA 的纯化与回收第31页
            1.2.5 cDNA 与 pBluescript Ⅱ质粒连接、转化、克隆和测序第31-32页
            1.2.6 序列测定及分析第32页
    2 结果与分析第32-37页
        2.1 总 RNA 的提取第32页
        2.2 双链 cDNA 的合成与 LD-PCR 扩增第32-33页
        2.3 均一化处理效果检测第33-34页
        2.4 cDNA 文库的质量评价第34页
        2.5 cDNA 文库测序结果分析第34-37页
            2.5.1 ESTs 长度及其分析第34页
            2.5.2 ESTs 序列分析与功能注释第34-37页
    3 讨论第37-40页
        3.1 cDNA 文库构建技术改进第37-38页
        3.2 cDNA 文库中 ESTs 序列分析第38-40页
第三章 木奈果实花青素合成酶基因(PsANS)和苯丙氨酸解氨酶基因(PsPAL)的分离与表达分析第40-54页
    1 材料与方法第41-43页
        1.1 植物材料与处理第41页
        1.2 试验方法第41-43页
            1.2.1 PsANS 基因和 PsPAL 基因的分离与序列分析第41-42页
            1.2.2 PsANS 基因和 PsPAL 基因组 DNA 序列的扩增第42页
            1.2.3 PAL 活性测定第42页
            1.2.4 PsANS 原核表达载体构建及在大肠杆菌 BL21 菌株中的表达第42-43页
            1.2.5 PsPAL 基因在木奈果实不同发育时期和采后果实在生物和非生物胁迫处理下的表达分析第43页
    2 结果与分析第43-50页
        2.1 PsANS 和 PsPAL 基因 cDNA 和 DNA 序列的获得与分析第43-47页
        2.2 PAL 活性变化第47-48页
        2.3 PsANS 的原核表达分析第48-49页
        2.4 PsPAL 在木奈果实不同生长发育时期的表达模式分析第49页
        2.5 PsPAL 在木奈果实采后各种胁迫处理下的表达模式分析第49-50页
    3 讨论第50-54页
        3.1 PsANS 基因的克隆与序列分析第50-51页
        3.2 PsPAL 基因的克隆及序列分析第51-52页
        3.3 PsPAL 基因的表达模式分析第52-54页
第四章 三个膨胀素基因在木奈果实生长发育及采后各种胁迫下的表达分析第54-70页
    1 材料与方法第55-57页
        1.1 植物材料与方法第55页
        1.2 试验方法第55-57页
            1.2.1 3 个膨胀素基因的分离与序列分析第55-56页
            1.2.2 3 个膨胀素基因组 DNA 序列的扩增第56页
            1.2.3 3 个膨胀素基因启动子的分离与序列分析第56-57页
            1.2.4 3 个膨胀素基因在木奈叶片和果实中的表达模式分析第57页
            1.2.5 3 个膨胀素基因在木奈果实不同生长发育时期和采后各种生物胁迫和非生物胁迫下的表达分析第57页
    2 结果与分析第57-67页
        2.1 3 个膨胀素基因的分离与序列分析第57-61页
        2.2 3 个膨胀素基因基因组序列分析第61页
        2.3 3 个膨胀素基因启动子序列克隆与分析第61-62页
        2.4 3 个膨胀素基因在木奈叶片和果实中的表达模式分析第62-63页
        2.5 3 个膨胀素基因在木奈果实不同生长发育时期的表达分析第63页
        2.6 3 个膨胀素基因在木奈果实机械损伤褐变过程中的表达模式分析第63-65页
        2.7 3 个膨胀素基因在木奈果实采后各种非生物胁迫和乙烯处理下的表达模式分析第65-67页
    3 讨论第67-70页
        3.1 木奈膨胀素编码一个多基因家族第67页
        3.2 木奈PsEXP 基因的内含子结构分析第67-68页
        3.3 木奈PsEXP 基因的表达模式分析第68页
        3.4 木奈PsEXP 基因的表达可能受各种因素的调控第68-70页
第五章 木奈果实 NAC 转录因子的分离与表达分析第70-86页
    1 材料与方法第73-76页
        1.1 植物材料与处理第73页
        1.2 试验方法第73-76页
            1.2.1 NAC 基因的分离与序列分析第73-74页
            1.2.2 载体构建第74-75页
            1.2.3 亚细胞定位分析第75页
            1.2.4 瞬间表达分析第75页
            1.2.5 转录激活活性分析第75页
            1.2.6 PsNAC 基因启动子的分离与序列分析第75页
            1.2.7 PsNAC 基因表达模式分析第75-76页
    2 结果与分析第76-83页
        2.1 木奈NAC 基因全长 cDNA 的分离与序列分析第76页
        2.2 木奈NAC 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析第76-79页
        2.3 木奈PsNAC 与 NAC 识别元件 NACRS 的瞬间表达分析第79页
        2.4 木奈PsNAC 的亚细胞定位分析第79页
        2.5 木奈PsNAC 在酵母细胞中的转录激活活性分析第79-80页
        2.6 木奈PsNAC 基因启动子序列克隆与分析第80-81页
        2.7 PsNAC 基因在木奈果实采后的表达模式分析第81-83页
            2.7.1 PsNAC 基因在木奈褐变果和未褐变果中以及机械损伤后的表达模式第81-82页
            2.7.2 PsNAC 基因在木奈采后各种非生物胁迫和乙烯处理下的表达模式分析第82-83页
    3 讨论第83-86页
        3.1 PsNAC 蛋白的结构特征分析第83-84页
        3.2 PsNAC 基因可能与木奈果实衰老相关,在褐变过程中发挥着作用第84-86页
第六章 木奈果实 WRKY 类转录因子的分离与表达分析第86-100页
    1 材料与方法第89-91页
        1.1 植物材料与处理第89页
        1.2 试验方法第89-91页
            1.2.1 WRKY 基因的分离与序列分析第89-90页
            1.2.2 载体构建第90页
            1.2.3 亚细胞定位分析第90页
            1.2.4 瞬间表达分析第90页
            1.2.5 转录激活活性分析第90-91页
            1.2.6 木奈WRKY 基因启动子的分离与序列分析第91页
            1.2.7 木奈WRKY 基因表达模式分析第91页
    2 结果与分析第91-97页
        2.1 木奈WRKY 基因全长 cDNA 的分离与序列分析第91页
        2.2 木奈WRKY 基因系统进化分析第91-94页
        2.3 木奈PsWRKY 与 W 盒特异性结合分析第94页
        2.4 木奈PsWRKY 的亚细胞定位分析第94-95页
        2.5 木奈PsWRKY 的在酵母细胞中的转录激活活性分析第95页
        2.6 木奈PsWRKY 基因启动子序列克隆与分析第95-96页
        2.7 PsWRKY 基因在木奈果实采后的表达模式分析第96-97页
            2.7.1 PsWRKY 基因在木奈褐变果和未褐变果中以及机械损伤后的表达模式第96-97页
            2.7.2 PsWRKY 基因在木奈采后各种非生物胁迫和乙烯处理下的表达模式分析第97页
    3 讨论第97-100页
        3.1 首次从木奈物种中分离了 WRKY 转录因子第97-98页
        3.2 WRKY 类转录因子参与调控植物植物生长发育及次生代谢途径第98页
        3.3 WRKY 类转录因子参与植物非生物胁迫第98-100页
第七章 木奈生长发育过程中和受机械损伤后 PPO 基因的表达第100-106页
    1 材料与方法第100-101页
        1.1 植物材料与处理第100页
        1.2 试验方法第100-101页
            1.2.1 木奈成熟叶片均一化全长 cDNA 文库构建第100页
            1.2.2 PPO 基因的筛选与序列分析第100页
            1.2.3 PPO 基因在生长发育和受机械损伤后的表达模式分析第100-101页
            1.2.4 PPO 活性的测定第101页
    2 结果与分析第101-104页
        2.1 PsPP02 基因的分离与序列分析第101-103页
        2.2 木奈不同的生长发育时期 PPO 基因的表达第103页
        2.3 木奈成熟果实受机械损伤后 PPO 基因的表达和 PPO 酶活性的变化第103-104页
    3 讨论第104-106页
第八章 结论与展望第106-108页
参考文献第108-129页
附录第129-140页
    附录 1 木奈苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列第129-131页
    附录 2 木奈PsEXP1 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列以及启动子序列和内含子序列第131-133页
        2.1 木奈PsEXP1 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列第131-132页
        2.2 木奈PsEXP1 基因启动子序列第132页
        2.3 木奈PsEXP1 基因内含子序列第132-133页
    附录 3 木奈PsEXP2 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列以及启动子序列和内含子序列第133-135页
        3.1 木奈PsEXP2 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列第133-134页
        3.2 木奈PsEXP2 基因启动子序列第134页
        3.3 木奈PsEXP2 基因内含子序列第134-135页
    附录4 木奈PsEXP3基因cDNA全长序列及推定的氨基酸序列以及启动子序列和内含子序列第135-137页
        4.1 木奈PsEXP3 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列第135-136页
        4.2 木奈PsEXP3 基因启动子序列第136页
        4.3 木奈PsEXP3 基因内含子序列第136-137页
    附录 5 木奈PsNAC 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列以及启动子序列第137-139页
        5.1 木奈PsNAC 基因 cDNA 全长序列及推定的氨基酸序列第137-138页
        5.2 木奈PsNAC 基因启动子序列第138-139页
    附录 6 木奈PsWRKY 基因启动子序列第139-140页
博士就读期间发表论文情况第140-141页
致谢第141页
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论文编号ABS559333,这篇论文共141页
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