研究背景和目的常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是人类最常见的单基因遗传性肾病,发病率约为1/400-1/1000,我国约有150万患者,占终末期肾衰病因的第三位(5—10%),其主要病理特征为肾脏出现众多进行性增大的液性囊泡,最终破坏肾脏的结构和损害肾功能;50%患者在60岁时进展至终末期肾衰。ADPKD除累及肾脏外,还可引起肝、胰囊肿、心瓣膜病、结肠憩室和颅内动脉瘤等肾外病变。该病家系代代发病,子代发病机率为50%,是一类严重危害人类健康的系统性疾病。ADPKD囊肿形成及进展的病理生理过程主要有:细胞增殖和凋亡异常,细胞极性改变和分化不良,细胞外基质重塑、间质纤维化及液体分泌增加。虽则,ADPKD的致病基因已经明确主要为pkd1和pkd2,但其发病机制仍然不是十分清楚,目前研究已经证明其涉及细胞内多条信号通路的异常,如:cAMP—PKA(cAMP:cyclic adenosine monophosphate,环磷酸腺苷;PKA:protein kinase A,蛋白激酶A)信号通路、生长因子相关信号通路、Wnt(wingless-type MMTV integration site family)信号通路、哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)相关信号通路等,其单一或协同作用引起囊泡衬里上皮细胞异常增殖和囊液过度分泌而导致囊泡的产生和发展。Notch信号通路是一条保守的信号传导途径,广泛存在于从无脊椎动物到脊椎动物等多个物种。Notch信号通路由受体、配体和DNA结合蛋白3部分构成。相邻细胞上的受体和配体结合后导致受体构象改变暴露出蛋白水解酶的酶切位点,并经随后2次蛋白水解作用释放出具有核定位信号的胞内段(Notch intracellular domain,NICD),转位进入细胞核内;激活其下游靶基因,参与调控细胞的分化、增殖和凋亡。Notch信号通路的活化过程中,受体变构后的蛋白水解作用至关重要;在γ-分泌酶(γ-Secretase)的作用下直接释放出具有活性的NICD。实验证实γ-分泌酶抑制剂可特异性的抑制γ-分泌酶的活性,减少NICD的释放,从而抑制Notch通路的活化。目前在哺乳动物中已发现Notch信号通路4种同源受体,即Notch l~4和5种同源配体:Delta-l、Delta-3、Delta-4、Jagged-1、Jagged-2以及两类下游靶基因:Hes和Hey家族。研究发现Notch信号通路与肾、神经干细胞、肺、胰腺、软骨以及前列腺等组织和器官的分化发育密切相关。作为一种类肿瘤性疾病,ADPKD肾组织中是否存在Notch信号通路相关蛋白的表达,Notch信号通路是否也在多囊肾病发生发展过程中发挥作用?尚未见相关报道。因此,本课题旨在阐明Notch信号通路在ADPKD发生中的作用,并探讨抑制Notch信号对ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖的影响及其具体机制;研究Notch信号通路与ADPKD进展中发挥重要作用的mTOR信号通路之间的相互调控关系,为常染色体显性多囊肾病的治疗提供新的药物作用靶点。实验方法1、采用real time PCR方法观察ADPKD患者和正常对照肾组织中Notch信号通路受体Notch 1~4、配体Jagged1和下游靶基因hes1 mRNA水平的表达差异;2、采用Western blotting方法分析ADPKD患者和正常对照肾组织中Notch信号通路受体Notch1,配体Jagged1和下游靶基因Hes1蛋白水平的表达差异;3、采用免疫组织化学方法观察ADPKD患者和正常对照肾组织中Notch信号通路受体Notch1,配体Jagged1和下游靶基因Hes1的表达及细胞定位差异;4、采用MTT方法,以肾小管上皮细胞RCTEC为对照,检测不同浓度(0、1、2、5、10nmol/L)的DBZ(γ-分泌酶抑制剂——特异性Notch抑制剂)对ADPKD囊肿衬里上皮细胞WT9-12的增殖抑制作用;5、采用RNAi方法特异性抑制Notch1信号,观察对ADPKD囊肿衬里上皮细胞WT9-12周期的影响,并用Western blotting方法验证结果。6、不同浓度(0、5、10nmol/L)的DBZ(γ-分泌酶抑制剂——特异性Notch信号抑制剂)干预ADPKD囊肿衬里上皮细胞WT9-12,用Western blotting方法检测Notch1、Hes1的表达以验证Notch信号通路的下调;7、用Western blotting方法检测DBZ下调Notch信号后mTOR通路重要信号分子mTOR及其活性形式p-mTOR的表达情况;8、用Western blotting方法检测DBZ下调Notch信号后mTOR下游信号分子4E-Bp1及其活性形式p-4E-Bp1的表达情况;9、用Western blotting方法检测DBZ下调Notch信号后mTOR下游信号分子pS706K及其活性形式p-pS706K的表达情况。结果1、采用免疫组织化学染色技术,发现在人的正常肾组织中,Notch1、Jagged1主要分布在肾小管上皮细胞胞浆,表达较弱;在ADPKD肾囊肿组织中主要表达于胞浆及胞核中,且呈强阳性表达。2、采用real time PCR方法检测到人ADPKD肾组织中Notch信号通路分子受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、配体Jagged1和下游靶基因hes1 mRNA的表达水平明显高于正常肾组织。3、采用Western blotting方法检测到人ADPKD肾组织中受体Notch1、配体Jagged1和下游靶基因Hes1的蛋白表达明显高于相应正常肾组织。4、采用MTT法检测γ分泌酶抑制剂DBZ对WT9-12细胞的增殖抑制。结果发现10nmol/L DBZ作用24小时对细胞增殖的抑制率达60%以上,而对正常肾小管细胞RCTEC无明显增殖抑制作用。这种增殖抑制作用对浓度的升高而增大,但无明显的时间依赖性,说明下调Notch通路抑制囊肿衬里上皮细胞的增殖作用是迅速有效的。5、采用RNAi的方法特异性干扰囊肿衬里上皮细胞WT9-12中的Notch1,流式细胞术检测其对细胞周期的影响,发现其将细胞周期阻滞在S期,Western blotting方法检测发现P21下调而负性调节蛋白Cyclin A上调,与流式细胞术的结果一致。6.、采用Western blotting方法发现Notch通路抑制剂DBZ在下调Notch1/Hes1通路的同时也下调了mTOR信号通路中mTOR、p-mTOR、p-4E-Bp1、p-p70S6K的表达。结论本研究从mRNA、蛋白表达水平以及组织细胞定位等多个层面证实常染色体显性多囊肾病肾组织中Notch信号通路被异常激活,并可能为囊肿发生发展的重要原因之一。通过体外实验观察发现Notch通路抑制剂可以抑制肾囊肿衬里上皮细胞的增殖;这种抗细胞增殖作用是通过阻滞细胞周期于S期以抑制细胞分裂实现的。当肾囊肿衬里上皮细胞内Notch信号通路被抑制后,mTOR信号通路也受到相应的调节,该通路信号分子下调。这提示我们,细胞内Notch信号通路被下调后,不仅抑制其下游靶基因发挥抗增殖作用,且能同时通过调节mTOR通路发挥协同作用。这为ADPKD的提供了一个新的有效的治疗靶点。
